Name: covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry at JoVE.com

يعترف المؤلفون بدعم المعاهد الوطنية للصحة (NIH) بموجب منحة R01 GM075092. تم الحصول على مطياف الكتلة الحرارية Orbitrap فيوجن المستخدمة للحصول على بعض البيانات الموصوفة هنا بأموال من المنحة الوطنية للمعاهد الصحية S10OD010645.

1. إعداد البروتين والكواشف
ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول على سبيل المثال سير العمل لتسمية بروتين مع DEPC. قد تختلف بعض الحالات وتركيزات الكاشف المذكورة استنادا إلى البروتين المفضل.
<ol><li>إعداد جميع حلول الكاشف في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.</li>
	<li>إعداد محلول البروتين من ا...

الخطوات الهامة وينبغي النظر في عدة نقاط تتعلق بالتصميم التجريبي لضمان نتائج موثوقة لوضع العلامات. أولا، لتحقيق أقصى قدر من وضع العلامات البروتين، فمن الضروري تجنب المخازن المؤقتة مع مجموعات نوى بقوة (على سبيل المثال، تريس) لأنها يمكن أن تتفاعل مع DEPC وانخفاض مدى وضع العلامات. ومن ال?...

البروتينات هي الجزيئات الحيوية الأساسية في كل عملية فسيولوجية تقريبا. إن تنوع الوظائف التي تؤديها البروتينات ممكن بسبب الهياكل التي تعتمدها والتفاعلات التي لديها مع الجزيئات الحيوية الأخرى. لفهم وظيفة البروتين على مستوى أعمق، هناك حاجة إلى أدوات بيوكيميائية وبيولوجية فيزيائية لتوضيح هذه السمات والتفاعلات الهيكلية الهامة. تقليديا، قدمت الأشعة السينية البلورية، المجهر الإلكتروني المبرد، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفية التفاصيل المطلوبة على المستوى الذري للكشف عن بنية البروتين. ومع ذلك، لا يمكن استجواب العديد من أنظمة البروتين من خلال هذه التقنيات بسبب سوء سلوك التبلور، وتوافر البروتين المحدود، والتباين المفرط في العينة، أو قيود الوزن الجزيئي. ونتيجة لذلك، ظهرت أساليب تحليل أحدث تتغلب على هذه القيود. ومن بين التقنيات الناشئة التي يمكن أن توفر المعلومات الهيكلية البروتين هو قياس الطيف الكتلي.
يقيس قياس الطيف الكتلي (MS) نسبة الكتلة إلى الشحنة للجزيء (m/z)، لذلك يجب الحصول على المعلومات الهيكلية عالية الترتيب للبروتين عن طريق ترميز المعلومات الهيكلية المطلوبة في كتلة البروتين. وقد تم تطوير عدة طرق لترميز هذه المعلومات، بما في ذلك تبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX)1،2،3،4، الربط المتبادل الكيميائي (XL)5،6، ووضع العلامات التساهمية (CL)7،8،9،10. في HDX، يتم تبادل العمود الفقري وسط الهيدروجين من قبل الديوتريوم أكثر قليلا ضخمة بمعدلات تعتمد على إمكانية الوصول المذيبات ومدى الترابط H. يمكن ترجمة مدى HDX عن طريق هضم البروتين بسرعة إلى شظايا الببتيد قبل فصل وقياس هذه الشظايا عن طريق مطياف الكتلة أو عن طريق فصل البروتين في تجربة من أعلى إلى أسفل. تحديد سعر الصرف يوفر المزيد من التبصر في ديناميات البروتين. وقد ثبت HDX لتكون أداة قيمة لتميز بنية البروتين على الرغم من التحديات المرتبطة تبادل الظهر والحاجة إلى معدات متخصصة لتحقيق أقصى قدر من الاستنساخ. في XL-MS، يتم تفاعل البروتينات مع الكواشف ثنائية الوظائف التي تربط بشكل مشترك بين السلاسل الجانبية للبقايا المجاورة داخل بروتين معين أو بين بروتينين. عند القيام بذلك، يمكن أن توفر XL-MS قيود المسافة التي يمكن استخدامها لتوصيف بنية البروتين. يمكن تحديد مناطق البروتين المرتبطة عبر عن طريق الهضم البروتيولي يليها تحليل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS. في حين أن XL-MS هو أداة متعددة الاستخدامات تم استخدامها لدراسة مجموعة متنوعة من مجمعات البروتين ، بما في ذلك داخل الخلايا ، فإن تحديد منتجات XL أمر صعب ويتطلب برامج متخصصة.
وقد برز CL-MS مؤخرا كأداة تكميلية وأحيانا بديلة تعتمد على التصلب المتعدد لدراسة بنية البروتين والتفاعلات. في CL-MS، يتم تعديل مجمع البروتين أو البروتين بشكل مكافئ مع كاشف أحادي الوظائف يمكن أن يتفاعل مع سلاسل جانبية معرضة للمذيبات(الشكل 1). من خلال مقارنة مدى تعديل مجمع البروتين أو البروتين في ظل ظروف مختلفة ، يمكن الكشف عن تغييرات تشكيل ، ومواقع ملزمة ، وواجهات البروتين والبروتين. بعد تفاعل CL ، يمكن الحصول على معلومات خاصة بالموقع ، غالبا على مستوى الأحماض الأمينية الواحدة ، باستخدام سير عمل البروتيوميات النموذجي من أسفل إلى أعلى حيث يتم هضم البروتينات بشكل بروتيوكليتيكي ، ويتم فصل شظايا الببتيد بواسطة LC ، ويتم تحديد المواقع المعدلة باستخدام MS جنبا إلى جنب (MS / MS). وقد أتاح التاريخ الغني لكيمياء التكيف البيولوجي العديد من الكواشف لتجارب CL-MS. وتندرج الكواشف الخاصة ب CL في فئتين عامتين: '1' محددة و'2' غير محددة. الكواشف محددة تتفاعل مع مجموعة وظيفية واحدة (على سبيل المثال، الأمينات الحرة)8،10 وسهلة التنفيذ ، لكنها تميل إلى توفير معلومات هيكلية محدودة. وتتفاعل الكواشف غير المحددة مع مجموعة واسعة من السلاسل الجانبية، ولكنها غالبا ما تتطلب معدات متخصصة مثل الليزر أو مصادر السنكروترون لإنتاج هذه الأنواع شديدة التفاعل. هيدروكسيل الجذور هي الكاشف غير محددة الأكثر استخداما، بعد أن تم تطبيقها في البصمة الراديكالية الهيدروكسيل (HRF)7،11،12،13 التجارب لدراسة مجموعة واسعة من البروتينات والمجمعات البروتينية في ظل مجموعة متنوعة من الشروط.
وقد استخدمت مجموعتنا البحثية بنجاح كاشفا آخر غير محدد نسبيا يسمى ديثيليبيروكربونات (DEPC) لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في سياق تجارب CL-MS14و15و16و17و18و19و20و21و22و 23و 24و25. DEPC يقدم بساطة الكواشف وضع العلامات محددة (أي، لا توجد معدات متخصصة ضرورية لأداء ردود الفعل)، في حين تتفاعل مع ما يصل إلى 30٪ من الأحماض الأمينية في البروتين المتوسط. كمكشف كهربائي للغاية ، DEPC قادر على التفاعل مع N-terminus والسلاسل الجانبية النووية من السيستين والهستيدين والليسين والتيروزين وسيرين ومخلفات الثريونين. عادة، يتم إنشاء منتج واحد من هذه التفاعلات، مما أدى إلى زيادة كتلة من 72.02 دا. هذا النوع واحد من المنتجات يتناقض مع ما يصل إلى 55 المنتجات المختلفة التي يمكن أن تنتج عندما تتفاعل البروتينات مع الجذور الهيدروكسيل7. هذه الكيمياء البسيطة تسهل تحديد المواقع المسماة.
هنا، نحن نقدم بروتوكولات لاستخدام CL-MS المستندة إلى DEPC لدراسة بنية البروتين والتفاعلات. يتم وصف التفاصيل المرتبطة بإعداد الكاشف ، وتفاعلات البروتين DEPC ، وظروف هضم البروتين ، ومعلمات LC-MS و MS / MS ، وتحليل البيانات. كما أننا نثبت فائدة وضع العلامات على DEPC من خلال تقديم نتائج نموذجية من التفاعلات بين البروتين والمعدن والبروتين والبروتين بالإضافة إلى البروتينات التي تخضع لتغييرات هيكلية عند التدفئة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap RSLC C18 Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164537</td>
			<td>300 &#956;m x 15 cm, C18, 2 &#956;m, 100 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized chymotrypsin</td>
			<td>ProteoChem</td>
			<td>g4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry

إن توصيف بنية البروتين ذات الترتيب الأعلى أمر ضروري لفهم وظيفته. وقد برز قياس الطيف الكتلي كأداة قوية لهذا الغرض، وخاصة بالنسبة لأنظمة البروتين التي يصعب دراستها بالطرق التقليدية. لدراسة بنية البروتين عن طريق التصلب المتعدد ، يتم إجراء تفاعلات كيميائية محددة في محلول يشفر المعلومات الهيكلية للبروتين في كتلته. أحد النهج الفعالة بشكل خاص هو استخدام الكواشف التي تعدل بشكل مشترك المذيبات سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية يمكن الوصول إليها. تؤدي ردود الفعل هذه إلى زيادات كتلية يمكن توطينها بدقة على مستوى المخلفات عند دمجها مع الهضم البروتيوليكي وقياس الطيف الكتلي المترادف. هنا، نحن نصف البروتوكولات المرتبطة باستخدام ديثيليبيروكربونات (DEPC) ككواشف وضع العلامات التساهمية جنبا إلى جنب مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. DEPC هو جزيء كهربائي للغاية قادر على وضع علامات تصل إلى 30٪ من المخلفات في البروتين المتوسط ، وبالتالي توفير دقة هيكلية ممتازة. وقد استخدمت DEPC بنجاح جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد للحصول على معلومات هيكلية للبروتينات الصغيرة ذات المجال الواحد، مثل β2-microglobulin، إلى البروتينات الكبيرة متعددة المجالات، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة.

تحديد مواقع تعديل DEPC ونسب التعديل ويمكن قياس الإضافة الشاملة بسبب وضع العلامات التساهمية في (أ) البروتين سليمة و (ب) مستويات الببتيد8،9. على مستوى سليم، يمكن الحصول على توزيع أنواع البروتين مع أعداد مختلفة من التسميات من التحليل المباشر أو LC-MS من عينات ...

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry at JoVE.com

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

يتم وصف الإجراءات التجريبية لأداء الوسم التساهمي القائم على النظام الغذائي مع الكشف الطيفي الشامل. يتم خلط Diethylpyrocarbonate ببساطة مع مجمع البروتين أو البروتين من الفائدة، مما يؤدي إلى تعديل بقايا الأحماض الأمينية المذيبات التي يمكن الوصول إليها. ويمكن تحديد المخلفات المعدلة بعد الهضم البروتيولي وتحليل الكروماتوغرافيا السائلة/قياس الطيف الكتلي.

وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

إن توصيف بنية البروتين أمر ضروري لفهم وظيفتها. وقد برز قياس الطيف الكتلي كأداة قوية لهذا الغرض، وخاصة بالنسبة لأنظمة البروتين التي يصعب دراستها بالطرق التقليدية. لدراسة بنية البروتين حسب المواصفات الشاملة ، يتم إجراء تفاعلات كيميائية محددة في محلول يشفر معلومات هيكلية بروتينية في كتلته.أحد النهج الفعالة بشكل خاص هو استخدام الكواشف التي تعدل بشكل مشترك حل الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها السلاسل الجانبية. هذه التفاعلات تؤدي إلى زيادات الكتلة التي يمكن توطينها مع دقة مستوى المخلفات عندما يقترن الهضم البروتيوليك وقياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. هنا، وصفنا البروتوكولات المرتبطة باستخدام ديثيل بيروكربونات أو DEPC كمكشف وضع العلامات التكافؤ جنبا إلى جنب مع الكشف عن المواصفات الشامل.DEPC هو جزيء كهربائي للغاية قادر على وضع علامات تصل إلى 30٪ من المخلفات في البروتين المتوسط ، وبالتالي توفير دقة هيكلية ممتازة. وقد استخدمت بنجاح DEPC جنبا إلى جنب مع المواصفات الشامل للحصول على معلومات هيكلية لكثير من البروتينات المختلفة. ابدأ بإعداد محلول عازل للبروتين الخاص بك من الفائدة بتركيز في نطاق عشرات الكائنات الدقيقة.نحن عادة استخدام 10 ملليمولار pH 7.4 MOPS العازلة. بدلا من ذلك، قد يكون محلول البروتين الموجود تبادل المخزن المؤقت في MOPS أو مخزن مؤقت آخر إذا كانت العينة الأصلية تحتوي على مخزن مؤقت يحتوي على مجموعات وظيفية نيوكليوفيليا. من الضروري أن العازلة لا يكون المجموعات الوظيفية النووية لأنها سوف تتداخل مع رد فعل البروتين DEPC.في microtube مختلفة، وإعداد حل الأسهم من DEPC 100 ملليمولار في أسيتونيتريل الجافة. إعداد محلول المخزون في أسيتونيتريل الجاف ضروري لمنع التحلل المائي من DEPC. في ميكروتوب جديد، وإعداد حل واحد imidazole الضرس في المياه HPLC الصف.في الميكروبيوب الجديد، اخلطي العازلة MOPS ومحلول البروتينات. إلى البروتين وعازلة إضافة aliquot من محلول الأسهم DEPC التأكد من انها مزيج بشكل صحيح قبل وضع خليط رد الفعل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. يجب اختيار حجم محلول مخزون DEPC المستخدم استنادا إلى نسبة تركيز البروتين النهائية DEPC المطلوبة.لا توجد مجموعة واحدة من تركيزات DEPC والبروتين التي ستعمل مع كل بروتين ، على الرغم من أن تركيز DEPC الأمثل يمكن تقديره استنادا إلى عدد بقايا الهستيدين واليوزين التي يمكن الوصول إليها الموجودة في البروتين. وتجدر الإشارة إلى أن حجم acetonitrile المضافة، وهو على نحو فعال حجم الحل DEPC المضافة لا ينبغي أن يتجاوز 1٪ من حجم التفاعل الكلي لتجنب اضطراب بنية البروتين أثناء رد الفعل. وقت رد الفعل هو في نهاية المطاف متروك للمستخدم، على الرغم من رد فعل دقيقة واحدة تحت شرط المثال يقلل من وضع العلامات على البروتين والتحلل المائي من DEPC.بعد مرور دقيقة واحدة، إخماد رد الفعل عن طريق إضافة imidazole لمسح المتبقية على DEPC رد فعل. التأكد من أن التركيز النهائي للimidazole هو 50 مرة تركيز DEPC. لتحديد المخلفات التي تم تعديلها من قبل DEPC ، يجب هضم البروتين بروتيوكليتيكيا إلى شظايا الببتيد.بالنسبة للهضم، اختر الشروط القابلة للبروتين المثير للاهتمام. الخطوات الشائعة التي يتم وصفها هنا تنطوي على البروتين تتكشف ومن ثم الحد من والروابط ثنائي الكبريتيد alkylating بحيث يمكن تحسين كفاءة الهضم. في تجربتنا، تتكشف البروتين مع denaturant والحرارة قبل الهضم يحسن كفاءة الهضم.بينما يجري الكشف عن البروتين, قارن حلول TCEP و iodoacetamide في عازلة الهضم المناسبة. يجب استخدام TCEP كعامل تقليل بدلا من dithiothreitol أو DTT لأن DTT يمكن أن تتفاعل مع المخلفات المعدلة DEPC. Alkylation من الملفات الناتجة بعد التخفيض أمر ضروري لتجنب تسمية الهرولة التي الملفات الحرة والبروتين تتفاعل مع الأحماض الأمينية المعدلة.بمجرد الانتهاء من الخطوة التي تتكشف، والحد من السندات ثاني كبريتيد عن طريق إضافة TCEP إلى خليط رد الفعل والسماح لها تتفاعل لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخفيض، إضافة iodoacetamide إلى خليط التفاعل، والسماح لها تتفاعل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. يتحقق هنا عن طريق وضع خليط التفاعل في مربع.التركيز النهائي من iodoacetamide ينبغي أن يكون ضعف التركيز المستخدم لتيسيب أو 80 مرة تركيز البروتين أو السندات ديسولفيد. إعداد إنزيم الفائدة, عادة تريبسين أو chymotrypsin وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. بعد إعداد إنزيم الاختيار، ابدأ عملية الهضم واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية.نسبة البروتين إلى الإنزيم 10:1 مع عملية هضم لمدة ثلاث ساعات باستخدام الإنزيمات المشلومة عادة ما تكون خيارا جيدا للبروتينات المسماة DEPC. بعد الهضم، يجب إما تحليل العينة فورا بواسطة LC-MS/MS أو فلاش مجمد بالنيتروجين السائل لتقليل تدهور العينة وفقدان التسمية. يمكن استخدام معلمات LC-MS/MS القياسية للبروتيوميات من أسفل إلى أعلى لتحديد المواقع المسماة على شظايا الببتيد البروتيوليكية.وينبغي استخدام المرحلة العكسية C18 ثابتة لتحقيق أفضل فصل للببتيدات. في تجربتنا، يوفر LC الشعرية معلومات كمية أكثر موثوقية حول مستويات التعديل من نانو LC بسبب كميات العينة الأعلى المستخدمة. تتكون مرحلة LC المتنقلة النموذجية التي تستخدم لفصل الببتيدات المسماة DEPC من مذيبين.المذيبات A هو الماء مع 0.1٪ حمض الفورميك والمذيبات B هو أسيتونيتريل مع حمض الفورميك 0.1٪. يتم استخدام elution متدرجة ويمكن تحسين وقت الفصل استنادا إلى تعقيد العينة. مطلوب مطياف كتلة قادرة على القيام LC-MS على الانترنت وMS / MS لتحديد مواقع تعديل DEPC على الببتيدات.في تجاربنا، استخدمنا بنجاح عدة أنواع من مطياف الكتلة. لقد وجدنا أن Thermo Orbitrap Fusion يوفر نتائج ممتازة ، على الرغم من أن أي مطياف كتلي قادر على أداء MS / MS تلقائيا للعديد من الببتيدات أثناء تحليل LC-MS يجب أن يكون مناسبا. يجب تعيين شروط HPLC والمعلمات الطيفية الشاملة بشكل صحيح قبل القياس.إذا تم تجميد العينة فلاش، ينبغي أن تذوب الحق قبل التحليل. بذل قصارى جهدكم لتقليل الوقت بين إعداد العينة وحقن HPLC. تحميل وحقن هضم عينة البروتين المسمى في نظام LC وبدء اكتساب LC-MS / MS أو تحديد موقع التسمية DEPC وكمية منطقة الذروة، توجد أساليب متعددة.على أدوات ثيرمو فيشر، ربما تستخدم excalibur أو مكتشف البروتيوم. تعيين معلمات مناسبة لتعريف الببتيد في برنامج. يتم تضمين DEPC إضافة والكربوهيدراتايميثيل كتعديلات متغيرة تساعد على المخلفات أو تخصيصها.وتستخدم مناطق الذروة الكروماتوغرافية للإصدارات المعدلة وغير المعدلة من الببتيدات لتحديد نسب تعديل مستوى المخلفات. DEPC وضع العلامات مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد هو أيضا أداة قيمة لتميز أعلى ترتيب التغييرات الهيكلية للبروتينات. من دراستنا، يمكن وضع العلامات التكافؤ DEPC تحديد مناطق البروتين المحددة التي تخضع لتغيرات هيكلية على الإجهاد الحراري والأكسدي.وفي الشكل، تظهر تغييرات كبيرة في نسب التعديل باللون الأزرق لانخفاض وضع العلامات والأحمر للزيادة في وضع العلامات، في حين تظهر المخلفات التي لا توجد بها تغييرات كبيرة في وضع العلامات باللون الأخضر الشاحب. على سبيل المثال، بعد تعرض بيتا-2 ميكروجلوبولين للإجهاد الحراري، العديد من المخلفات التي تخضع لانخفاض كبير في مدى وضع العلامات، N-terminus، سيرين 28، هيستيدين 31، سيرين 33، سيرين 55، سيرين 57، وليسين 58 هي أقرب من جانب واحد من البروتين مما يشير إلى أن هذه المنطقة من البروتين يخضع لتغيير تأكيدي أو ربما تتوسط. بعد تعرض البروتين للإجهاد التأكسدي ، والمخلفات المختلفة مع انخفاض في وضع العلامات ، سيرين 11 ، الهستيدين 13 ، ليسين 19 ، ليسين 41 ، وليسين 94 من مجموعة على مرحلة أخرى من البروتين مما يشير إلى أن الأكسدة تسبب في تغيير تأكيدي يحدث في مكان آخر.هذه الدراسة لها آثار هامة على العلاج البروتين، والتي هي حاليا، الجزء الأسرع نموا في سوق الأدوية. وقد أظهرت أعمال أخرى من مجموعتنا أيضا أن DEPC الوسم التساهمي المواصفات الشامل يمكن الكشف عن وتحديد مواقع التغيرات التأكيدية في العلاجات الأجسام المضادة أحادية النسيلة وشدد. كما ترون، وضع العلامات التساهمية مع DEPC بسيط لتنفيذ تجريبيا، ولكن يمكن أن توفر معلومات هيكلية قيمة للبروتينات.الدقة الهيكلية التي تقدمها DEPC وضع العلامات المواصفات الشامل متواضعة بالمقارنة مع تقنيات مثل التصوير البلوري بالأشعة السينية وNMR، لكنه قابل لأي بروتين تقريبا بغض النظر عن حجمه أو قدرته على أن يتبلور. DEPC التساهمي وضع العلامات المواصفات الشامل يعمل أيضا مع خليط البروتين ويمكن أن تعمل مع أنواع العينة معقدة جدا، مثل lysate الخلية وخلايا هاكات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ونحن واثقون من أن تجد DEPC وضع العلامات أداة مفيدة لتميز بنية البروتين.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

دراسة في Complexation من الزئبق (II) مع Dicysteinyl Tetrapeptides التي كتبها Electrospray التأين الطيف الكتلي

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

تصور المحيطة الطيف الكتلي مع استخدام انعراجي التصوير الفوتوغرافي

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

تحليل التنفس في الوقت الحقيقي باستخدام التأين نانوليكتروسبراي الثانوية بالإضافة إلى دقة عالية الطيف الكتلي

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

ترسيب البروتين العضوي القائم على المذيبات لتنقية البروتيوم القوية قبل قياس الطيف الكتلي

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...