Name: covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00
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Les auteurs reconnaissent le soutien des National Institutes of Health (NIH) dans le cadre de la subvention R01 GM075092. Le spectromètre de masse Thermo Orbitrap Fusion utilisé pour acquérir certaines des données décrites ici a été acquis avec des fonds de la subvention S10OD010645 des National Institutes of Health.

1. Préparation de protéines et de réactifs
Remarque : ce protocole inclut un exemple de flux de travail pour le étiquetage d’une protéine avec DEPC. Certaines conditions et concentrations de réactifs énumérées peuvent varier en fonction de la protéine de choix.
<ol><li>Préparer toutes les solutions réactives dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
	<li>Préparer une solution protéique de la concentration désirée, habituellement de l’ordre de dizaines de μM, ...

Étapes critiques Plusieurs points concernant la conception expérimentale devraient être pris en compte pour assurer des résultats d’étiquetage fiables. Tout d’abord, pour maximiser l’étiquetage des protéines, il est nécessaire d’éviter les tampons avec des groupes fortement nucléophiles (par exemple, Tris) car ils peuvent réagir avec le DEPC et réduire l’étendue de l’étiquetage. Il est également concevable que de tels tampons puissent réagir avec des résidus étiquetés, entraîna...

Les protéines sont des biomolécules essentielles dans pratiquement tous les processus physiologiques. La variété des fonctions que les protéines remplissent est possible en raison des structures qu’elles adoptent et des interactions qu’elles ont avec d’autres biomolécules. Pour comprendre la fonction des protéines à un niveau plus profond, des outils biochimiques et biophysiques sont nécessaires pour élucider ces caractéristiques et interactions structurelles importantes. Traditionnellement, la cristallographie aux rayons X, la microscopie électronique cryogénique et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont fourni le détail de niveau atomique souhaité pour révéler la structure des protéines. Cependant, de nombreux systèmes protéiques ne peuvent pas être interrogés par ces techniques en raison d’un comportement de cristallisation médiocre, d’une disponibilité limitée des protéines, d’une hétérogénéité excessive des échantillons ou de limitations de poids moléculaire. Par conséquent, de nouvelles méthodes d’analyse ont vu le jour pour surmonter ces limites. Parmi les techniques émergentes qui peuvent fournir des informations structurelles sur les protéines, il y a la spectrométrie de masse.
La spectrométrie de masse (MS) mesure le rapport masse/charge (m/z) d’une molécule, de sorte que les informations structurelles d’ordre supérieur des protéines doivent être obtenues en codant les informations structurelles souhaitées dans la masse de la protéine. Plusieurs approches pour coder ces informations ont été développées, notamment l’échange hydrogène-deutérium (HDX)1,2,3,4,la réticulation chimique (XL)5,6,et le étiquetage covalent (CL)7,8,9,10. Dans HDX, les hydrogènes d’amide de base sont échangés par des deutériums légèrement plus massifs à des vitesses qui dépendent de l’accessibilité des solvants et de l’étendue de la liaison H. L’étendue de HDX peut être localisée en digérant rapidement la protéine en fragments peptidiques avant de séparer et de mesurer ces fragments par le spectromètre de masse ou en dissociant la protéine dans une expérience descendante. La détermination du taux de change fournit un aperçu supplémentaire de la dynamique des protéines. HDX s’est avéré être un outil précieux pour caractériser la structure des protéines malgré les défis associés à l’échange de dos et le besoin d’équipement spécialisé pour maximiser la reproductibilité. Dans XL-MS, les protéines réagissent avec des réactifs bi-fonctionnels qui lient de manière covalent les chaînes latérales de résidus adjacentes au sein d’une protéine donnée ou entre deux protéines. Ce faisant, XL-MS peut fournir des contraintes de distance qui peuvent être utilisées pour caractériser la structure des protéines. Les régions de la protéine qui sont réticulées peuvent être identifiées par digestion protéolytique suivie d’une analyse par chromatographie liquide (LC)-MS. Bien que XL-MS soit un outil polyvalent qui a été utilisé pour étudier une variété de complexes protéiques, y compris les cellules internes, l’identification des produits XL est difficile et nécessite un logiciel spécialisé.
La CL-MS est apparue récemment comme un outil complémentaire et parfois alternatif basé sur la SEP pour étudier la structure et les interactions des protéines. Dans la CL-MS, une protéine ou un complexe protéique est modifié de manière covalente avec un réactif mono-fonctionnel qui peut réagir avec des chaînes latérales exposées au solvant (Figure 1). En comparant les degrés de modification d’une protéine ou d’un complexe protéique dans différentes conditions, des changements de conformation, des sites de liaison et des interfaces protéine-protéine peuvent être révélés. Après la réaction CL, des informations spécifiques au site, souvent au niveau d’un seul acide aminé, peuvent être obtenues à l’aide de flux de travail protéomiques ascendants typiques dans lesquels les protéines sont digérées protéolytiquement, les fragments peptidiques sont séparés par LC et les sites modifiés sont identifiés à l’aide de la SP en tandem (MS / MS). La riche histoire de la chimie bioconjuguée a rendu de nombreux réactifs disponibles pour les expériences cl-ms. Les réactifs cl se répartissent en deux grandes catégories: (i) spécifique et (ii) non spécifique. Des réactifs spécifiques réagissent avec un seul groupe fonctionnel (p. ex. amines libres)8,10 et sont faciles à mettre en œuvre, mais ils ont tendance à fournir des informations structurelles limitées. Les réactifs non spécifiques réagissent avec une large gamme de chaînes latérales, mais nécessitent souvent des équipements spécialisés tels que des lasers ou des sources synchrotron pour produire ces espèces hautement réactives. Les radicaux hydroxyles sont le réactif non spécifique le plus couramment utilisé, ayant été appliqué dans les expériences d’empreintes de radicaux hydroxyles (HRF)7,11,12,13 pour étudier un large éventail de protéines et de complexes protéiques dans diverses conditions.
Notre groupe de recherche a utilisé avec succès un autre réactif relativement non spécifique appelé diéthylpyrocarbonate (DEPC) pour étudier la structure et les interactions des protéines dans le contexte des expériences CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC offre la simplicité de réactifs d’étiquetage spécifiques (c’est-à-dire qu’aucun équipement spécialisé n’est nécessaire pour effectuer les réactions), tout en réagissant avec jusqu’à 30% d’acides aminés dans la protéine moyenne. En tant que réactif hautement électrophile, DEPC est capable de réagir avec le N-terminus et les chaînes latérales nucléophiles de la cystéine, de l’histidine, de la lysine, de la tyrosine, de la sérine et des résidus de thréonine. Typiquement, un seul produit de ces réactions est généré, ce qui entraîne une augmentation de masse de 72,02 Da. Ce type unique de produit contraste avec les jusqu’à 55 produits différents qui peuvent être produits lorsque les protéines réagissent avec les radicaux hydroxyles7. Une telle chimie simple facilite l’identification des sites étiquetés.
Ici, nous fournissons des protocoles pour l’utilisation de CL-MS à base de DEPC pour étudier la structure et les interactions des protéines. Les détails associés à la préparation des réactifs, aux réactions des protéines DEPC, aux conditions de digestion des protéines, aux paramètres LC-MS et MS/MS, ainsi qu’à l’analyse des données sont décrits. Nous démontrons également l’utilité du étiquetage DEPC en fournissant des exemples de résultats d’interactions protéine-métal, protéine-ligand et protéine-protéine ainsi que de protéines subissant des changements structurels lors du chauffage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap RSLC C18 Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164537</td>
			<td>300 &#956;m x 15 cm, C18, 2 &#956;m, 100 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized chymotrypsin</td>
			<td>ProteoChem</td>
			<td>g4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry

La caractérisation de la structure d’ordre supérieur d’une protéine est essentielle pour comprendre sa fonction. La spectrométrie de masse (SEP) est apparue comme un outil puissant à cette fin, en particulier pour les systèmes protéiques difficiles à étudier par des méthodes traditionnelles. Pour étudier la structure d’une protéine par MS, des réactions chimiques spécifiques sont réalisées en solution qui codent l’information structurelle d’une protéine dans sa masse. Une approche particulièrement efficace consiste à utiliser des réactifs qui modifient de manière covalente les chaînes latérales d’acides aminés accessibles aux solvants. Ces réactions conduisent à des augmentations de masse qui peuvent être localisées avec une résolution au niveau des résidus lorsqu’elles sont combinées à la digestion protéolytique et à la spectrométrie de masse en tandem. Ici, nous décrivons les protocoles associés à l’utilisation du diéthylpyrocarbonate (DEPC) comme réactif de étiquetage covalent avec la détection de milliseconde. Le DEPC est une molécule hautement électrophile capable de étiqueter jusqu’à 30% des résidus dans la protéine moyenne, offrant ainsi une excellente résolution structurelle. Le DEPC a été utilisé avec succès avec ms pour obtenir des informations structurelles pour de petites protéines à domaine unique, telles que la β2-microglobuline, aux grandes protéines multi-domaines, telles que les anticorps monoclonaux.

Identification des sites de modification de DEPC et des pourcentages de modification L’addition de masse due au marquage covalent peut être mesurée aux niveaux (a) de protéines intactes et (b) depeptides 8,9. Au niveau intact, une distribution d’espèces protéiques avec différents nombres d’étiquettes peut être obtenue à partir d’une analyse directe ou de LC-MS d’échantillons de protéines marqués. Pour obtenir des renseignements s...

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Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Les procédures expérimentales pour effectuer un marquage covalent à base de diéthylpyrocarbonate avec détection spectrométrique de masse sont décrites. Le diéthylpyrocarbonate est simplement mélangé avec la protéine ou le complexe protéique d’intérêt, conduisant à la modification des résidus d’acides aminés accessibles aux solvants. Les résidus modifiés peuvent être identifiés après digestion protéolytique et analyse chromatographie liquide/spectrométrie de masse.

Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

La caractérisation d’une structure protéique est essentielle pour comprendre sa fonction. La spectrométrie de masse est apparue comme un outil puissant à cette fin, en particulier pour les systèmes protéiques difficiles à étudier par des méthodes traditionnelles. Pour étudier une structure protéique par spécification de masse, des réactions chimiques spécifiques sont réalisées en solution qui codent une information structurelle protéique dans sa masse.Une approche particulièrement efficace consiste à utiliser des réactifs qui modifient de manière covalente la résolution des chaînes latérales d’acides aminés accessibles. Ces réactions conduisent à des augmentations de masse qui peuvent être localisées avec une résolution de niveau de résidus lorsqu’elles sont combinées avec la digestion protéolytique et la spectrométrie de masse en tandem. Ici, nous avons décrit les protocoles associés à l’utilisation du pyrocarbonate de diéthyle ou du DEPC comme réactif d’étiquetage covalent ainsi que la détection des spécifications de masse.DEPC est une molécule hautement électrophile capable de étiqueter jusqu’à 30% des résidus dans la protéine moyenne, offrant ainsi une excellente résolution structurelle. DEPC a été utilisé avec succès avec des spécifications de masse pour obtenir des informations structurelles pour de nombreuses protéines différentes. Commencez par préparer une solution tamponnée de votre protéine d’intérêt à une concentration de l’ordre de dizaines de micromolaires.Nous utilisons couramment un tampon MOPS à pH 10 millimolaire de 7,4. Alternativement, une solution protéique existante peut être un échange tampon en MOPS ou un autre tampon si l’échantillon d’origine contient un tampon qui a des groupes fonctionnels nucléophiles. Il est nécessaire que le tampon n’ait pas de groupes fonctionnels nucléophiles car ils interféreront avec la réaction de la protéine DEPC.Dans un autre microtube, préparer une solution mère de 100 millimolaires de DEPC dans de l’acétonitrile sec. La préparation de la solution mère dans de l’acétonitrile sec est nécessaire pour prévenir l’hydrolyse du DEPC. Dans un nouveau microtube, préparer la solution d’un imidazole molaire dans de l’eau de qualité HPLC.Dans un nouveau microtube, mélanger le tampon MOPS et la solution de protéines. À la protéine et au tampon, ajoutez une partie aliquote de la solution mère de DEPC en vous assurant qu’elle est correctement mélangée avant de placer le mélange réactionnel dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une minute. Le volume de la solution mère de DEPC utilisée doit être choisi en fonction du rapport de concentration en protéines DEPC final souhaité.Il n’y a pas un seul ensemble de concentrations de DEPC et de protéines qui fonctionnera avec chaque protéine, bien que la concentration optimale de DEPC puisse être estimée en fonction du nombre de résidus d’histidine et de lysine accessibles aux solvants présents dans la protéine. Il convient de noter que le volume d’acétonitrile ajouté, qui est effectivement le volume de la solution de DEPC ajoutée ne doit pas dépasser 1% du volume total de réaction afin d’éviter une perturbation de la structure protéique au cours de la réaction. Le temps de réaction dépend en fin de compte de l’utilisateur, bien qu’une réaction d’une minute dans la condition d’exemple minimise le sur-étiquetage de la protéine et l’hydrolyse du DEPC.Après une minute s’est écoulée, étanchez la réaction en ajoutant l’imidazole pour récupérer le reste sur le DEPC réagi. S’assurer que la concentration finale d’imidazole est 50 fois la concentration de DEPC. Pour identifier les résidus qui ont été modifiés par DEPC, la protéine doit être digérée protéolytiquement en fragments peptidiques.Pour la digestion, choisissez des conditions qui se prêtent aux protéines d’intérêt. Les étapes courantes décrites ici impliquent le dépliage des protéines, puis la réduction et l’alkylation des liaisons disulfures afin que l’efficacité de la digestion puisse être améliorée. D’après notre expérience, le dépliage de la protéine avec un démentissant et de la chaleur avant la digestion améliore l’efficacité de la digestion.Pendant le dépliage des protéines, comparez les solutions de PTCE et d’iodoacétamide dans un tampon de digestion approprié. Le PTCE doit être utilisé comme agent réducteur au lieu du dithiothreitol ou de la TNT, car la TNT peut réagir avec les résidus modifiés par le DEPC. L’alkylation des fichiers résultants après réduction est essentielle pour éviter le brouillage de l’étiquette dans lequel les fichiers libres et la protéine réagissent avec des acides aminés modifiés.Une fois l’étape de dépliage terminée, réduisez les liaisons disulfures en ajoutant du PTCE au mélange réactionnel et laissez-le réagir pendant trois minutes à température ambiante. Après réduction, ajoutez l’iodoacétamide au mélange réactionnel, laissez-le réagir pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Obtenu ici en plaçant le mélange réactionnel dans une boîte.La concentration finale d’iodoacétamide doit être le double de la concentration utilisée pour le PTCE ou 80 fois la concentration en protéines ou la liaison disulfure. Préparez l’enzyme d’intérêt, généralement la trypsine ou la chymotrypsine selon les spécifications du fabricant. Après avoir préparé l’enzyme de choix, commencez la digestion et incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius.Un rapport protéine/enzyme de 10:1 avec une digestion de trois heures utilisant des enzymes immobilisées est typiquement un bon choix pour des protéines marqués de DEPC. Après la digestion, l’échantillon doit être immédiatement analysé par LC-MS/MS ou congelé avec de l’azote liquide afin de minimiser la dégradation de l’échantillon et la perte sur l’étiquette. Les paramètres LC-MS/MS standard pour la protéomique ascendante peuvent être utilisés pour identifier les sites marqués sur les fragments peptidiques protéolytiques.La phase stationnaire C18 en phase inverse doit être utilisée pour obtenir la meilleure séparation des peptides. D’après notre expérience, le LC capillaire fournit des informations quantitatives plus fiables sur les niveaux de modification que le nano LC en raison des quantités d’échantillons plus élevées utilisées. Une phase mobile LC typique qui est utilisée pour séparer les peptides marqués par DEPC est composée de deux solvants.Le solvant A est de l’eau avec de l’acide formique à 0,1% et le solvant B est un acétonitrile à 0,1% d’acide formique. Une élution de gradient est utilisée et le temps de séparation peut être optimisé en fonction de la complexité de l’échantillon. Un spectromètre de masse capable de faire de la LC-MS et de la MS/MS en ligne est nécessaire pour identifier les sites de modification de DEPC sur les peptides.Dans nos expériences, nous avons utilisé avec succès plusieurs types de spectromètres de masse. Nous avons constaté qu’un Thermo Orbitrap Fusion fournit d’excellents résultats, bien que tout spectromètre de masse capable d’effectuer automatiquement MS / MS de nombreux peptides au cours d’une analyse LC-MS devrait convenir. Les conditions HPLC et les paramètres spectrométriques de masse doivent être réglés correctement avant la mesure.Si l’échantillon a été congelé à l’éclair, il doit être décongelé juste avant l’analyse. Faites de votre mieux pour minimiser le temps entre la préparation de l’échantillon et l’injection de CLHP. Chargez et injectez l’échantillon de protéines étiquetées digérées dans le système LC et commencez l’acquisition LC-MS /MS ou l’identification du site de l’étiquette DEPC et la quantification de la zone de pointe, plusieurs méthodes existent.Sur les instruments Thermo Fisher, excalibur ou protéome découvreur peut-être utilisé. Définissez les paramètres appropriés pour l’identification des peptides dans un programme. L’addition et la carbamidométhylation de DEPC sont incluses en tant que modifications variables facilitant les résidus ou allouées.Les zones de pic chromatographique des versions modifiées et non modifiées des peptides sont utilisées pour déterminer les pourcentages de modification du niveau de résidus. L’étiquetage DEPC avec détection de la SEP est également un outil précieux pour caractériser les changements structurels d’ordre supérieur des protéines. À partir de notre étude, l’étiquetage covalent DEPC peut identifier des régions protéiques spécifiques qui subissent des changements structurels lors du stress thermique et oxydatif.Dans la figure, les changements significatifs dans les pourcentages de modification sont indiqués en bleu pour la diminution de l’étiquetage et en rouge pour l’augmentation de l’étiquetage, tandis que les résidus sans changements significatifs d’étiquetage sont indiqués en vert pâle. Par exemple, après que la bêta-2 microglobuline est exposée au stress thermique, de nombreux résidus qui subissent des diminutions significatives des étendues de marquage, N-terminus, sérine 28, histidine 31, sérine 33, sérine 55, sérine 57, et lysine 58 sont plus proches qu’un côté de la protéine suggérant que cette région de la protéine subit un changement de confirmation ou peut-être négocie l’agrégation. Après que la protéine soit exposée au stress oxydatif, différents résidus avec une diminution du étiquetage, la sérine 11, l’histidine 13, la lysine 19, la lysine 41 et la lysine 94 d’un cluster sur une autre phase de la protéine indiquant que le changement de confirmation induit par l’oxydation se produit ailleurs.Cette étude a des implications importantes pour les thérapies protéiques, qui sont actuellement le segment du marché pharmaceutique qui connaît la croissance la plus rapide. D’autres travaux de notre groupe ont également montré que la spécification de masse de marquage covalent DEPC peut détecter et identifier les sites des changements confirmationnels dans les thérapies d’anticorps monoclonal stressés. Comme vous pouvez le voir, l’étiquetage covalent avec DEPC est simple à mettre en œuvre expérimentalement, mais peut fournir des informations structurelles précieuses pour les protéines.La résolution structurelle fournie par la spécification de masse de marquage DEPC est modeste par rapport aux techniques comme la cristallographie aux rayons X et la RMN, mais elle se compare à presque toutes les protéines, quelle que soit sa taille ou sa capacité à être cristallisée. Depc covalent marquage de masse spec fonctionne également avec des mélanges de protéines et peut travailler avec des types d’échantillons très compliqués, tels que le lysat cellulaire et les cellules haCat. Après avoir regardé cette vidéo, nous sommes convaincus que vous trouverez le étiquetage DEPC un outil utile pour caractériser la structure des protéines.

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