Name: covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00
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Gli autori riconoscono il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) nell'ambito di Grant R01 GM075092. Lo spettrometro di massa Thermo Orbitrap Fusion utilizzato per acquisire alcuni dei dati qui descritti è stato acquisito con fondi della sovvenzione dei National Institutes of Health S10OD010645.

1. Preparazione di proteine e reagenti
NOTA: questo protocollo include un flusso di lavoro di esempio per l'etichettatura di una proteina con DEPC. Alcune condizioni e concentrazioni di reagenti elencate possono variare in base alla proteina scelta.
<ol><li>Preparare tutte le soluzioni di reagente in tubi microcentrifugo da 1,5 ml.</li>
	<li>Preparare una soluzione proteica della concentrazione desiderata, di solito nell'intervallo di decine di μM, in un tampone di acido propanosolfonico (M...

Passaggi critici Per quanto riguarda la progettazione sperimentale, si dovrebbero prendere in considerazione diversi punti per garantire risultati di etichettatura affidabili. In primo luogo, per massimizzare l'etichettatura delle proteine, è necessario evitare tamponi con gruppi fortemente nucleofili (ad esempio Tris) perché possono reagire con DEPC e abbassare l'estensione dell'etichettatura. È anche concepibile che tali tamponi possano reagire con residui etichettati, causando la rimozione dell'etichett...

Le proteine sono biomolecole essenziali praticamente in ogni processo fisiologico. La varietà di funzioni che le proteine svolgono sono possibili a causa delle strutture che adottano e delle interazioni che hanno con altre biomolecole. Per comprendere la funzione proteica a un livello più profondo, sono necessari strumenti biochimici e biofisici per chiarire queste importanti caratteristiche strutturali e interazioni. Tradizionalmente, la cristallografia a raggi X, la microscopia elettronica criogenica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) hanno fornito i dettagli desiderati a livello atomico per rivelare la struttura proteica. Tuttavia, numerosi sistemi proteici non possono essere interrogati da queste tecniche a causa dello scarso comportamento di cristallizzazione, della limitata disponibilità di proteine, dell'eccessiva eterogeneità del campione o delle limitazioni di peso molecolare. Di conseguenza, sono emersi metodi di analisi più nuovi che superano questi limiti. Tra le tecniche emergenti che possono fornire informazioni strutturali sulle proteine c'è la spettrometria di massa.
La spettrometria di massa (SM) misura il rapporto massa-carica (m/z) di una molecola, quindi le informazioni strutturali di ordine superiore delle proteine devono essere ottenute codificando le informazioni strutturali desiderate nella massa della proteina. Sono stati sviluppati diversi approcci per codificare queste informazioni, tra cui lo scambio idrogeno-deuterio (HDX)1,2,3,4, il crosslinking chimico (XL)5,6e l'etichettatura covalente (CL)7,8,9,10. In HDX, gli idrogenati di ammide dorsale vengono scambiati da deuterio leggermente più massicci a tassi che dipendono dall'accessibilità dei solventi e dall'estensione del legame H. L'estensione dell'HDX può essere localizzata digerendo rapidamente la proteina in frammenti peptidici prima di separare e misurare questi frammenti dallo spettrometro di massa o dissociando la proteina in un esperimento dall'alto verso il basso. Determinare il tasso di cambio fornisce ulteriori informazioni sulla dinamica proteica. HDX ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per caratterizzare la struttura proteica nonostante le sfide associate allo scambio posteriore e la necessità di apparecchiature specializzate per massimizzare la riproducibilità. In XL-MS, le proteine reagisce con reagenti bifunzionali che collegano covalentemente catene laterali di residui adiacenti all'interno di una data proteina o tra due proteine. In questo modo, XL-MS può fornire vincoli di distanza che possono essere utilizzati per caratterizzare la struttura proteica. Le regioni della proteina che sono reticate possono essere identificate dalla digestione proteolitica seguita da analisi della cromatografia liquida (LC)-MS. Mentre XL-MS è uno strumento versatile che è stato utilizzato per studiare una varietà di complessi proteici, tra cui celle interne, l'identificazione dei prodotti XL è impegnativa e richiede software specializzato.
Cl-MS è emerso di recente come uno strumento complementare e talvolta alternativo basato sulla SM per studiare la struttura e le interazioni proteiche. In CL-MS, un complesso proteico o proteico viene modificato covalentemente con un reagente monofunzionale in grado di reagire con catene laterali esposte al solvente (Figura 1). Confrontando le estensioni di modifica di un complesso proteico o proteico in diverse condizioni, è possibile rivelare cambiamenti di conformazione, siti di legame e interfacce proteina-proteina. Dopo la reazione CL, le informazioni specifiche del sito, spesso a livello di singolo amminoacido, possono essere ottenute utilizzando i tipici flussi di lavoro di proteomica bottom-up in cui le proteine vengono digerite proteoliticamente, i frammenti peptidici sono separati da LC e i siti modificati vengono identificati utilizzando la SM tandem (MS/MS). La ricca storia della chimica bioconiutogata ha reso disponibili numerosi reagenti per esperimenti CL-MS. I reagenti CL si suddividono in due categorie generali: i) specifiche e (ii) non specifiche. Reagenti specifici reagiscono con un singolo gruppo funzionale (ad esempio, ammine libere)8,10 e sono facili da implementare, ma tendono a fornire informazioni strutturali limitate. Reagenti non specifici reagiscono con una vasta gamma di catene laterali, ma spesso richiedono attrezzature specializzate come laser o sorgenti di sincrotrone per produrre queste specie altamente reattive. I radicali idrossilici sono il reagente non specifico più comunemente usato, essendo stati applicati in impronte di radicali idrossilici (HRF)7,11,12,13 esperimenti per studiare una vasta gamma di proteine e complessi proteici in una varietà di condizioni.
Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato con successo un altro reagente relativamente non specifico chiamato dietilpirocarbonato (DEPC) per studiare la struttura proteica e le interazioni nel contesto degli esperimenti CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC offre la semplicità di reagenti specifici per l'etichettatura (cioè, non è necessaria alcuna apparecchiatura specializzata per eseguire le reazioni), reagendo con fino al 30% di amminoacidi nella proteina media. Come reagente altamente elettrofilo, il DEPC è in grado di reagire con il N-terminale e le catene laterali nucleofile di cisteina, istidina, lisina, tirosina, serina e residui di treonina. Tipicamente, viene generato un singolo prodotto di queste reazioni, con un aumento di massa di 72,02 Da. Questo singolo tipo di prodotto contrasta con i fino a 55 diversi prodotti che possono essere prodotti quando le proteine reagiscono con radicali idrossilici7. Tale chimica semplice facilita l'identificazione dei siti etichettati.
Qui, forniamo protocolli per l'utilizzo di CL-MS basato su DEPC per studiare la struttura e le interazioni proteiche. Vengono descritti i dettagli associati alla preparazione dei reagenti, alle reazioni depc-proteina, alle condizioni di digestione proteica, ai parametri LC-MS e MS/MS e all'analisi dei dati. Dimostriamo anche l'utilità dell'etichettatura DEPC fornendo risultati di esempio dalle interazioni proteina-metallo, proteina-ligando e proteina-proteina, nonché proteine che subiscono cambiamenti strutturali al riscaldamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap RSLC C18 Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164537</td>
			<td>300 &#956;m x 15 cm, C18, 2 &#956;m, 100 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized chymotrypsin</td>
			<td>ProteoChem</td>
			<td>g4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry

Caratterizzare la struttura di ordine superiore di una proteina è essenziale per comprenderne la funzione. La spettrometria di massa (SM) è emersa come un potente strumento a questo scopo, specialmente per i sistemi proteici che sono difficili da studiare con i metodi tradizionali. Per studiare la struttura di una proteina da parte della SM, vengono eseguite reazioni chimiche specifiche in soluzione che codificano le informazioni strutturali di una proteina nella sua massa. Un approccio particolarmente efficace è quello di utilizzare reagenti che modifichino covalentemente catene laterali di amminoacidi accessibili ai solventi. Queste reazioni portano ad aumenti di massa che possono essere localizzati con risoluzione a livello di residuo se combinati con digestione proteolitica e spettrometria di massa tandem. Qui descriviamo i protocolli associati all'uso del dietilpirocarbonato (DEPC) come reagente di etichettatura covalente insieme al rilevamento MS. Il DEPC è una molecola altamente elettrofila in grado di etichettare fino al 30% dei residui nella proteina media, fornendo così un'eccellente risoluzione strutturale. Il DEPC è stato utilizzato con successo insieme alla SM per ottenere informazioni strutturali per piccole proteine monodominio, come la β2-microglobulina, a grandi proteine multidominio, come gli anticorpi monoclonali.

Identificazione dei siti di modifica DEPC e delle percentuali di modifica L'aggiunta di massa dovuta all'etichettatura covalente può essere misurata ai livelli di (a) proteina intatta e (b) peptidici8,9. A livello intatto, una distribuzione di specie proteiche con un numero diverso di etichette può essere ottenuta dall'analisi diretta o LC-MS di campioni proteici etichettati. Per ottenere informazioni strutturali a risoluzione più elevata (ad esemp...

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Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Vengono descritte le procedure sperimentali per l'esecuzione di etichette covalenti a base di dietilpirrocarbonato con rilevamento spettrometrico di massa. Il dietilpirrocarbonato viene semplicemente miscelato con il complesso proteico o proteico di interesse, portando alla modifica di residui di amminoacidi accessibili al solvente. I residui modificati possono essere identificati dopo la digestione proteolitica e l'analisi della cromatografia liquida/spettrometria di massa.

Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Caratterizzare una struttura proteica è essenziale per comprenderne la funzione. La spettrometria di massa è emersa come un potente strumento a questo scopo, specialmente per i sistemi proteici che sono difficili da studiare con i metodi tradizionali. Per studiare una struttura proteica per specifiche di massa, vengono eseguite reazioni chimiche specifiche in soluzione che codificano le informazioni strutturali di una proteina nella sua massa.Un approccio particolarmente efficace è quello di utilizzare reagenti che modificano covalentemente risolvendo catene laterali di amminoacidi accessibili. Queste reazioni portano ad aumenti di massa che possono essere localizzati con risoluzione del livello di residui se combinati con digestione proteolitica e spettrometria di massa tandem. Qui, abbiamo descritto i protocolli associati all'uso di dietil pirocarbonato o DEPC come un reagente di etichettatura covalente insieme al rilevamento di specifiche di massa.Il DEPC è una molecola altamente elettrofila in grado di etichettare fino al 30% dei residui nella proteina media, fornendo così un'eccellente risoluzione strutturale. Il DEPC è stato utilizzato con successo insieme alle specifiche di massa per ottenere informazioni strutturali per molte proteine diverse. Inizia preparando una soluzione tamponata della tua proteina di interesse a una concentrazione nell'intervallo di decine di micromolari.Comunemente usiamo un tampone MOPS da 10 millimolare pH 7.4. In alternativa, una soluzione proteica esistente può essere lo scambio tampone in MOPS o in un altro buffer se il campione originale contiene un tampone che ha gruppi funzionali nucleofili. È necessario che il buffer non abbia gruppi funzionali nucleofili perché interferiranno con la reazione proteica del DEPC.In un microtubo diverso, preparare una soluzione stock di 100 millimolare DEPC in acetonitrile secco. Preparare la soluzione di stock in acetonitrile secco è necessario per prevenire l'idrolisi del DEPC. In un nuovo microtubo, preparare la soluzione di un imidazolo molare in acqua di grado HPLC.In un nuovo microtubo, mescolare il buffer MOPS e la soluzione di proteine. Alla proteina e al tampone aggiungere un'aliquota della soluzione stock DEPC assicurandosi che la mescoli correttamente prima di posizionare la miscela di reazione in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per un minuto. Il volume della soluzione stock DEPC utilizzata deve essere scelto in base al rapporto di concentrazione finale delle proteine DEPC desiderato.Non esiste un solo insieme di concentrazioni di DEPC e proteine che funzionino con ogni proteina, anche se la concentrazione ottimale di DEPC può essere stimata in base al numero di residui di istidina e lisina accessibili al solvente presenti nella proteina. Va notato che il volume di acetonitrile aggiunto, che è effettivamente il volume della soluzione DEPC aggiunta non deve superare l'1% del volume totale di reazione in modo da evitare perturbazioni della struttura proteica durante la reazione. Il tempo di reazione dipende in ultima analisi dall'utente, anche se una reazione di un minuto nella condizione di esempio riduce al minimo l'etichettatura eccessiva della proteina e l'idrolisi del DEPC.Dopo un minuto, disseta la reazione aggiungendo l'imidazolo per scavenge il rimanente sul DEPC reagito. Assicurarsi che la concentrazione finale di imidazolo sia 50 volte la concentrazione di DEPC. Per identificare i residui modificati dal DEPC, la proteina deve essere digerita proteoliticamente in frammenti peptidici.Per la digestione, scegliere condizioni suscettibili alle proteine di interesse. I passaggi comuni descritti qui prevedono lo spiegamento di proteine e quindi la riduzione e l'alchilating dei legami disolfuro in modo che l'efficienza della digestione possa essere migliorata. Nella nostra esperienza, lo sviluppo della proteina con un denaturante e calore prima della digestione migliora l'efficienza della digestione.Mentre le proteine si stanno svolgendo, confrontare le soluzioni di TCEP e iodoacetamide in un appropriato tampone di digestione. Il TCEP deve essere usato come agente riducente al posto del ditiothreitol o del DTT perché il DTT può reagire con residui modificati depc. L'alchilazione dei file risultanti dopo la riduzione è essenziale per evitare il rimescolamento dell'etichetta in cui i file liberi e la proteina reagiscono con amminoacidi modificati.Una volta terminato il passaggio di dispiegamento, ridurre i legami disolfuro aggiungendo TCEP alla miscela di reazione e lasciarlo reagire per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo la riduzione, aggiungere iodoacetamide alla miscela di reazione, lasciarla reagire per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Ottenuto qui posizionando la miscela di reazione in una scatola.La concentrazione finale di iodoacetamide deve essere il doppio della concentrazione utilizzata per il TCEP o 80 volte la concentrazione proteica o il legame disolfuro. Preparare l'enzima di interesse, di solito tripina o chimotripsina secondo le specifiche del produttore. Dopo aver preparato l'enzima di scelta, iniziare la digestione e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius.Un rapporto proteina-enzima 10:1 con una digestione di tre ore utilizzando enzimi immobilizzati è tipicamente una buona scelta per le proteine etichettate DEPC. Dopo la digestione, il campione deve essere immediatamente analizzato da LC-MS/MS o congelato con azoto liquido per ridurre al minimo la degradazione del campione e la perdita di etichette. I parametri standard LC-MS/MS per la proteomica dal basso verso l'alto possono essere utilizzati per identificare siti etichettati sui frammenti peptidici proteolitici.La fase inversa C18 fase stazionaria dovrebbe essere utilizzata per ottenere la migliore separazione dei peptidi. Nella nostra esperienza, l'LC capillare fornisce informazioni quantitative più affidabili sui livelli di modifica rispetto al nano LC a causa delle maggiori quantità di campioni utilizzate. Una tipica fase mobile LC che viene utilizzata per separare i peptidi etichettati DEPC è composta da due solventi.Il solvente A è acqua con acido formico dello 0,1% e il solvente B è un acetonitrile con acido formico dello 0,1%. Viene utilizzata un'eluizione del gradiente e il tempo di separazione può essere ottimizzato in base alla complessità del campione. Uno spettrometro di massa in grado di eseguire online LC-MS e MS/MS è necessario per identificare i siti di modifica DEPC sui peptidi.Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato con successo diversi tipi di spettrometri di massa. Abbiamo scoperto che una fusione Thermo Orbitrap fornisce risultati eccellenti, anche se qualsiasi spettrometro di massa in grado di eseguire automaticamente MS / MS di molti peptidi durante un'analisi LC-MS dovrebbe essere adatto. Le condizioni HPLC e i parametri spettrometrici di massa devono essere impostati correttamente prima della misurazione.Se il campione è stato congelato, deve essere scongelato subito prima dell'analisi. Fare del tuo meglio per ridurre al minimo il tempo tra la preparazione del campione e l'iniezione HPLC. Caricare e iniettare il campione di proteine etichettate digerite nel sistema LC e avviare l'acquisizione LC-MS/MS o l'identificazione del sito dell'etichetta DEPC e la quantificazione dell'area di picco, esistono più metodi.Sugli strumenti Thermo Fisher, excalibur o proteome discoverer forse usato. Impostare parametri appropriati per l'identificazione peptidica in un programma. L'addizione di DEPC e la carbamidometilazione sono incluse come modifiche variabili che aiutano i residui o allocate.Le aree di picco cromatografiche delle versioni modificate e non modificate dei peptidi vengono utilizzate per determinare le percentuali di modifica del livello dei residui. L'etichettatura DEPC con rilevamento MS è anche uno strumento prezioso per caratterizzare cambiamenti strutturali di ordine superiore alle proteine. Dal nostro studio, l'etichettatura covalente DEPC può identificare specifiche regioni proteiche che subiscono cambiamenti strutturali sullo stress termico e ossidativo.Nella figura, variazioni significative delle percentuali di modifica sono mostrate in blu per la diminuzione dell'etichettatura e in rosso per l'aumento dell'etichettatura, mentre i residui senza modifiche significative dell'etichettatura sono mostrati in verde pallido. Ad esempio, dopo che la microglobulina beta-2 è esposta allo stress termico, molti residui che subiscono significative diminuzioni nelle estensioni di etichettatura, N-terminale, serina 28, istidina 31, serina 33, serina 55, serina 57 e lisina 58 sono più vicini di un lato della proteina suggerendo che questa regione della proteina subisce un cambiamento confermazionale o possibilmente media l'aggregazione. Dopo che la proteina è stata esposta a stress ossidativo, diversi residui con una diminuzione dell'etichettatura, serina 11, istidina 13, lisina 19, lisina 41 e lisina 94 da un ammasso su un'altra fase della proteina che indica che il cambiamento di conferma indotto dall'ossidazione si verifica altrove.Questo studio ha importanti implicazioni per le terapie proteiche, che sono attualmente il segmento in più rapida crescita del mercato farmaceutico. Altri lavori del nostro gruppo hanno anche dimostrato che le specifiche di massa covalenti dePC possono rilevare e identificare i siti di cambiamenti confermazionali nelle terapie antia anticorpali monoclonali stressate. Come potete vedere, l'etichettatura covalente con DEPC è semplice da implementare sperimentalmente, ma può fornire preziose informazioni strutturali per le proteine.La risoluzione strutturale fornita dalle specifiche di massa di etichettatura DEPC è modesta rispetto alle tecniche come la cristallografia a raggi X e la NMR, ma è suscettibile a quasi tutte le proteine indipendentemente dalle sue dimensioni o capacità di cristallizzarsi. Le specifiche di massa covalenti DEPC funzionano anche con miscele proteiche e possono funzionare con tipi di campioni molto complicati, come il llysato cellulare e le cellule haCat. Dopo aver visto questo video, siamo sicuri che troverai DEPC che etichetta uno strumento utile per caratterizzare la struttura proteica.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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