Name: covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00
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著者らは、グラントR01 GM075092の下で国立衛生研究所(NIH)からの支援を認めている。ここで説明したデータの一部を取得するために使用されるサーモオービトラップ核質量分析計は、国立衛生研究所の助成金S10OD010645からの資金で取得されました。

1. タンパク質および試薬の調製
注: このプロトコルには、DEPC でタンパク質を標識するワークフローの例が含まれています。一部の条件および試薬濃度は、選択したタンパク質に基づいて異なる場合があります。
<ol><li>1.5 mLマイクロ遠心チューブですべての試薬溶液を調製します。</li>
	<li>pH 7.4で所望の濃度のタンパク質溶液を、通常は数十μMの範囲で10 mM 3-(N-モルフォ?...

重要なステップ 実験計画に関するいくつかの点を考慮して、信頼性の高いラベル作成結果を確保する必要があります。まず、タンパク質標識を最大化するためには、DEPCと反応して標識の程度を低下させることができるため、強い求核基(例えば、Tris)を有する緩衝液を避ける必要がある。また、このようなバッファーが標識残基と反応し、ラベルの除去を引き起こし、したがって構?...

タンパク質は、事実上すべての生理学的プロセスにおいて不可欠な生体分子です。タンパク質が採用する構造と他の生体分子との相互作用のために、タンパク質が果たす様々な機能が可能です。タンパク質の機能を深く理解するためには、これらの重要な構造特徴と相互作用を解明するために生化学的および生物物理学的ツールが必要です。従来、X線結晶学、極低温電子顕微鏡、核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質構造を明らかにするために所望の原子レベルの詳細を提供してきました。しかし、結晶化の挙動、タンパク質の入手可能性の制限、過剰なサンプルの不均一性、分子量の制限など、これらの手法では、多数のタンパク質システムを問い合せることはできません。その結果、これらの制限を克服する新しい分析方法が登場しました。タンパク質の構造情報を提供できる新たな技術の中には、質量分析があります。
質量分析(MS)は分子の質量電荷(m/z)比を測定するため、所望の構造情報をタンパク質の質量にコードすることにより、タンパク質の高次構造情報を取得する必要があります。この情報をコード化するためのいくつかのアプローチは、水素重水素交換(HDX)1、2、3、4、化学架橋(XL)5、6、および共有結合標識(CL)7、8、9、10を含む開発された。HDXでは、溶媒の入手可能性とH結合の範囲に依存する速度でわずかに大きい重水素によって、骨格アミド水素が交換されます。HDXの範囲は、タンパク質をペプチド断片に素早く消化してから、質量分析計でこれらの断片を分離して測定するか、またはトップダウン実験でタンパク質を解離することによって局在化することができる。交換速度を決定することで、タンパク質のダイナミクスに関するさらなる洞察が得られます。HDXは、バック交換に伴う課題や、再現性を最大限に高める特殊な機器の必要性にも関わらず、タンパク質構造を特徴付けるための貴重なツールであることが証明されています。XL-MSでは、タンパク質は、特定のタンパク質内または2つのタンパク質間で隣接する残基側鎖を共有結合する二機能性試薬と反応する。その際、XL-MSは、タンパク質構造を特徴付けるために使用できる距離制約を提供することができます。架橋されたタンパク質の領域は、タンパク質分解消化と続く液体クロマトグラフィー(LC)-MS分析によって同定することができる。XL-MSは、細胞内を含む様々なタンパク質複合体を研究するために使用されてきた汎用性の高いツールですが、XL製品の同定は困難であり、特殊なソフトウェアが必要です。
CL-MSは、タンパク質の構造と相互作用を研究するための補完的で、時には代替MSベースのツールとして最近登場しました。CL-MSにおいて、タンパク質またはタンパク質複合体は、溶媒暴露側鎖と反応し得る単一機能試薬で共有修飾される(図1)。異なる条件下でタンパク質またはタンパク質複合体の修飾範囲を比較することにより、立体構造変化、結合部位、およびタンパク質-タンパク質のインターフェースが明らかになる。CL反応後、部位特異的情報は、多くの場合、単一アミノ酸レベルで、タンパク質がタンパク質分解され、ペプチド断片がLCによって分離され、改変部位がタンデムMS(MS/MS)を使用して同定される典型的なボトムアッププロテオミクスワークフローを使用して得ることができる。バイオコンジュゲート化学の豊富な歴史により、CL-MS実験に数多くの試薬が利用可能になりました。CL試薬は、(i)特異的および(ii)非特異的の2つの一般的なカテゴリーに分類される。特定の試薬は、単一の官能基(例えば、遊離アミン)8、10と反応し、実装が容易であるが、それらは限られた構造情報を提供する傾向がある。非特異的試薬は、広範囲の側鎖と反応しますが、多くの場合、これらの反応性の高い種を生成するためにレーザーやシンクロトロン源などの特殊な機器が必要です。ヒドロキシルラジカルは、最も一般的に使用される非特異的試薬であり、ヒドロキシルラジカルフットプリント(HRF)7、11、12、13実験を行い、様々な条件下で幅広いタンパク質およびタンパク質複合体を研究した。
我々の研究グループは、CL-MS実験14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25の文脈におけるタンパク質構造および相互作用を研究するために、ジエチルピロカーボネート(DEPC)と呼ばれる別の比較的非特異的な試薬を使用することに成功した。DEPCは、特定の標識試薬のシンプルさを提供し(すなわち、反応を行うために特別な装置は必要ありません)、一方で、平均タンパク質中のアミノ酸の最大30%と反応します。高い電気反応試薬として、DEPCはシステイン、ヒスチジン、リジン、チロシン、セリン、スレオニン残基のN末端および求核側鎖と反応することができる。典型的には、これらの反応の単一の産物が生成され、結果として72.02Daの質量増加が生じる。この単一タイプの製品は、タンパク質がヒドロキシルラジカルと反応するときに生成することができる最大55種類の製品と対比する7。このような単純な化学は、標識された部位の同定を容易にする。
ここでは、DEPCベースのCL-MSを用いてタンパク質の構造と相互作用を研究するためのプロトコルを提供します。試薬調製、DEPC-タンパク質反応、タンパク質消化条件、LC-MSおよびMS/MSパラメータ、およびデータ分析に関連する詳細が記載されています。また、タンパク質-金属、タンパクリガンド、タンパク質-タンパク質相互作用、加熱時に構造変化を起こしているタンパク質の結果の例を提供することで、DEPC標識の有用性を実証します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap RSLC C18 Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164537</td>
			<td>300 &#956;m x 15 cm, C18, 2 &#956;m, 100 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized chymotrypsin</td>
			<td>ProteoChem</td>
			<td>g4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry

タンパク質の高次構造を特徴付けて、その機能を理解するためには不可欠です。質量分析(MS)は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。MSによるタンパク質の構造を研究するために、タンパク質の構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われます。特に効果的なアプローチの1つは、溶媒のアクセス可能なアミノ酸側鎖を共有的に修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベルの分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、MS検出と共に共有標識試薬としてのジエチルピロカーボネート(DEPC)の使用に関連するプロトコルについて説明する。DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより優れた構造分解能を提供する。DEPCはMSと共に、β2-ミクログロブリンなどの小さな単一ドメインタンパク質の構造情報をモノクローナル抗体などの大きな多ドメインタンパク質に対して得るのに成功しています。

DEPC 変更サイトと変更率の特定 共有結合標識による質量付加は、(a)インタクトタンパク質及び(b)ペプチドレベル8,9で測定することができる。無傷レベルでは、標識数の異なるタンパク質種の分布を、直接分析またはLC-MSの標識タンパク質サンプルから得ることができます。より高い分解能構造情報(すなわち、部位特異的標識データ)を得る?...

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Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

タンパク質構造の特徴付けは、その機能を理解するために不可欠です。質量分析は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。質量スペックによるタンパク質構造の研究のために、タンパク質構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われる。特に効果的なアプローチの1つは、共有化して、解析可能なアミノ酸側鎖を修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベル分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、質量スペック検出と共に共有標識試薬としてのジエチルパイロカーボネートまたはDEPCの使用に関連するプロトコルについて説明した。DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより、優れた構造分解能を提供する。DEPCは、多くの異なるタンパク質の構造情報を得るためにマススペックと一緒にうまく使用されています。まず、目的のタンパク質の緩衝溶液を数十マイクロモルの範囲の濃度で調製します。我々は一般的に10ミリモルpH 7.4 MOPSバッファーを使用しています。あるいは、既存のタンパク質溶液は、元のサンプルが求核官能基を有する緩衝液を含む場合にMOPSまたは別のバッファーへのバッファー交換をすることができる。彼らはDEPCタンパク質反応を妨げるので、バッファーは、求核機能基を有しないことが必要です.別のマイクロチューブでは、乾燥アセトニトリルに100ミリモルDEPCのストック溶液を調製する。乾燥アセトニトリルでストック溶液を調製することは、DEPCの加水分解を防ぐために必要である。新しいマイクロチューブで、HPLCグレードの水に1モルイミダゾールの溶液を調製します。新しいマイクロチューブで、MOPSバッファーとタンパク質溶液を混合します。タンパク質とバッファーにDEPCストック溶液のアリコートを追加し、反応混合物を37°Cの水浴に1分間入れる前に適切に混合していることを確認します。使用されるDEPCストック溶液の体積は、望ましい最終的なDEPCタンパク質濃度比に基づいて選択されるべきである。すべてのタンパク質で動作するDEPCとタンパク質濃度のセットはありませんが、最適なDEPC濃度は、タンパク質に存在する溶媒アクセス可能なヒスチジンおよびリジン残基の数に基づいて推定することができます。なお、アセトニトリル添加の体積は、効果的に添加されるDEPC溶液の体積が、反応中のタンパク質構造の摂動を避けるために全反応量の1%を超えてはならないことに留意すべきである。反応時間は最終的にユーザ次第であるが、例の条件下での1分間の反応は、DEPCのタンパク質の標識および加水分解を最小限に抑える。1分経過した後、反応したDEPC上で残りのを清掃するためにイミダゾールを添加することによって反応をクエンチする。イミダゾールの最終濃度がDEPC濃度の50倍であることを確認してください。DEPCによって修飾された残基を同定するために、タンパク質はタンパク質分解的にペプチド断片に消化されなければならない。消化のために、目的のタンパク質に適した条件を選択してください。ここで説明する一般的なステップは、タンパク質を展開し、消化効率を改善できるようにジスルフィド結合を減少およびアルキル化することを含む。我々の経験では、消化前に変性剤と熱でタンパク質を展開すると、消化の効率が向上します。タンパク質が展開されている間、適切な消化バッファー内のTCEPとヨウドアセトアミドの溶液を比較します。DTTはDEPC改変残基と反応することができるので、TCEPはジチオスレイトールまたはDTTの代わりに還元剤として使用されるべきである。還元後に得られるファイルのアルキル化は、フリーファイルとタンパク質が改変アミノ酸と反応する標識スクランブルを避けるために不可欠です。展開ステップが完了したら、反応混合物にTCEPを加えて二硫化物結合を減らし、室温で3分間反応させます。還元後、反応混合物にヨウアドアセトアミドを加え、暗闇の中で室温で30分間反応させた。ここで、反応混合物を箱に入れることによって達成する。ヨウドアセトアミドの最終濃度は、TCEPに使用される濃度の2倍、またはタンパク質濃度またはジスルフィド結合の80倍である必要があります。目的の酵素を準備します, 通常、メーカーの仕様に従ってトリプシンまたはキモトリプシン.選択した酵素を調製した後、消化を開始し、37°Cで反応混合物をインキュベートします。固定化酵素を用いた3時間の消化を伴う10:1タンパク質と酵素比は、典型的にはDEPC標識タンパク質に適した選択である。消化後、試料は直ちにLC-MS/MSで分析するか、液体窒素で凍結して、サンプルの劣化と標識の損失を最小限に抑える必要があります。ボトムアッププロテオミクスの標準LC-MS/MSパラメータは、タンパク質分解ペプチド断片上の標識部位を同定するために使用することができます。逆相C18定常相は、ペプチドの最良の分離を達成するために使用されるべきである。当社の経験では、キャピラリーLCは、使用されるサンプル量が多いため、ナノLCよりも修飾レベルに関するより信頼性の高い定量情報を提供します。DEPC標識ペプチドを分離するために使用される典型的なLC移動相は、2つの溶媒で構成される。溶媒Aは0.1%のギ酸を含む水であり、溶媒Bは0.1%のギ酸を有するアセトニトリルである。勾配溶出が使用され、サンプルの複雑さに基づいて分離時間を最適化できます。オンラインLC-MSおよびMS/MSを行うことができる質量分析計は、ペプチド上のDEPC修飾部位を同定するために必要とされる。我々の実験では、質量分析計のいくつかのタイプを使用することに成功しました。我々は、熱軌道融解核が優れた結果を提供することを発見したが、LC-MS分析の過程で多くのペプチドのMS/MSを自動的に行うことができる質量分析計は適切であるべきである。測定前にHPLC条件と質量分析パラメータを適切に設定する必要があります。サンプルがフラッシュフリーズされている場合は、分析の直前に解凍する必要があります。サンプル調製とHPLC注入の間の時間を最小限に抑えるために最善を尽くしてください。LCシステムに消化された標識タンパク質サンプルをロードして注入し、LC-MS/MSの取得またはDEPCラベルサイトの同定およびピーク面積の定量を開始し、複数の方法が存在する。サーモフィッシャーの機器では、エクスカリバーまたはプロテオームの発見者が使用される可能性があります。プログラムでペプチドの同定に適切なパラメータを設定します。DEPC付加およびカルバミドメチル化は、残基を補助または割り当てる可変的な修飾として含まれる。ペプチドの修飾および未改変バージョンのクロマトグラフィーピーク領域は、残基レベルの修飾パーセンテージを決定するために使用される。MS検出によるDEPC標識は、タンパク質に対する高次構造変化を特徴付けるための貴重なツールでもあります。我々の研究から、DEPC共有結合標識は熱および酸化的ストレスの構造変化を受ける特定の蛋白質領域を同定できる。この図では、ラベル付けの増加に対しては変更率の有意な変化が青色で示され、ラベル付けの増加に対して赤色が示され、有意な標識変更のない残基は淡い緑色で示されています。例えば、β-2ミクログロブリンが熱ストレスにさらされた後、標識範囲の有意な減少を受ける多くの残基は、N末端、セリン28、ヒスチジン31、セリン33、セリン55、セリン57、およびリジン58がこのタンパク質の領域がタンパク質の一方の側よりも近いことを示唆している。タンパク質が酸化ストレスにさらされた後、標識の減少を伴う異なる残基は、セリン11、ヒスチジン13、リジン19、リジン41、およびリジン94が他の場所で酸化誘導された確認変化が起こることを示す別の相のクラスターからなる。この研究は、現在、医薬品市場で最も急速に成長している分野であるタンパク質治療薬にとって重要な意味を持っています。我々のグループからの他の研究はまた、DEPC共有標識質量スペックがストレスモノクローナル抗体治療の確認変化の部位を検出し、同定できることを示している。ご覧のように、DEPCによる共有ラベルは実験的に実装するのが簡単ですが、タンパク質に対する貴重な構造情報を提供することができます。DEPC標識質量の質量の分析によって提供される構造分解能は、X線結晶学やNMRのような技術と比較すると控えめですが、そのサイズや結晶化能力に関係なく、ほぼすべてのタンパク質に適しています。DEPC共有バレントラベリング質量スペックは、タンパク質混合物でも作用し、細胞ライセートやhaCat細胞などの非常に複雑なサンプルタイプで動作します。このビデオを見た後、私たちはDEPCがタンパク質構造を特徴付けるための有用なツールを標識することを確信しています。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...