Name: covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00
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Os autores reconhecem o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o Grant R01 GM075092. O espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Fusion usado para adquirir alguns dos dados aqui descritos foi adquirido com recursos do Instituto Nacional de Saúde s10OD010645.

1. Preparação de proteínas e reagentes
NOTA: Este protocolo inclui um fluxo de trabalho de exemplo para rotular uma proteína com DEPC. Algumas condições e concentrações de reagentes listadas podem variar de acordo com a proteína escolhida.
<ol><li>Prepare todas as soluções de reagente em tubos de microcentrifus de 1,5 mL.</li>
	<li>Prepare uma solução proteica de concentração desejada, geralmente na faixa de dezenas de μM, em um tampão de ácido propanesulfônico de 10 mM 3-...

Passos críticos Vários pontos relativos ao design experimental devem ser considerados para garantir resultados confiáveis de rotulagem. Primeiro, para maximizar a rotulagem de proteínas, é necessário evitar buffers com grupos fortemente nucleofílicos (por exemplo, Tris) porque eles podem reagir com o DEPC e diminuir a extensão da rotulagem. Também é concebível que tais tampões possam reagir com resíduos rotulados, causando a remoção do rótulo e, portanto, a perda de informações estruturais. ...

Proteínas são biomoléculas essenciais em praticamente todos os processos fisiológicos. A variedade de funções que as proteínas realizam são possíveis devido às estruturas que adotam e às interações que têm com outras biomoléculas. Para entender a função proteica em um nível mais profundo, ferramentas bioquímicas e biofísicas são necessárias para elucidar essas importantes características e interações estruturais. Tradicionalmente, a cristalografia de raios-X, a microscopia eletrônica criogênica e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) forneceram o detalhe desejado do nível atômico para revelar a estrutura proteica. No entanto, inúmeros sistemas proteicos não podem ser interrogados por essas técnicas devido ao mau comportamento de cristalização, disponibilidade limitada de proteínas, heterogeneidade excessiva da amostra ou limitações de peso molecular. Consequentemente, surgiram novos métodos de análise que superam essas limitações. Entre as técnicas emergentes que podem fornecer informações estruturais proteicas está a espectrometria de massa.
A espectrometria de massa (MS) mede a relação massa-carga (m/z) de uma molécula, de modo que informações estruturais de alta ordem proteica devem ser obtidas codificando as informações estruturais desejadas na massa da proteína. Várias abordagens para codificar essas informações foram desenvolvidas, incluindo troca de deutério de hidrogênio (HDX)1,2,3,4, crosslinking químico (XL)5,6, e rotulagem covalente (CL)7,8,9,10. Em HDX, os hidrogênios de amido de espinha dorsal são trocados por deutérios ligeiramente mais massivos a taxas que dependem da acessibilidade solvente e da extensão de ligação H. A extensão do HDX pode ser localizada digerindo rapidamente a proteína em fragmentos de peptídeos antes de separar e medir esses fragmentos pelo espectrômetro de massa ou dissolvendo a proteína em um experimento de cima para baixo. Determinar a taxa de câmbio fornece mais informações sobre a dinâmica das proteínas. A HDX provou ser uma ferramenta valiosa para caracterizar a estrutura proteica, apesar dos desafios associados à troca traseira e da necessidade de equipamentos especializados para maximizar a reprodutibilidade. No XL-MS, as proteínas são reagidas com reagentes bifuncionais que ligam covalentemente cadeias laterais de resíduos dentro de uma determinada proteína ou entre duas proteínas. Ao fazer isso, o XL-MS pode fornecer restrições de distância que podem ser usadas para caracterizar a estrutura proteica. As regiões da proteína que estão cruzadas podem ser identificadas pela digestão proteolítica seguida de cromatografia líquida (LC)-MS. Embora o XL-MS seja uma ferramenta versátil que tem sido usada para estudar uma variedade de complexos proteicos, incluindo células internas, a identificação dos produtos XL é desafiadora e requer software especializado.
O CL-MS emergiu recentemente como uma ferramenta complementar e às vezes alternativa baseada em MS para estudar a estrutura e as interações proteicas. Em CL-MS, um complexo proteico ou proteico é covalentemente modificado com um reagente monofuncional que pode reagir com cadeias laterais expostas a solventes(Figura 1). Comparando as extensões de modificação de um complexo proteico ou proteico em diferentes condições, mudanças de conformação, locais de ligação e interfaces proteína-proteína podem ser reveladas. Após a reação cl, informações específicas do local, muitas vezes no nível único de aminoácidos, podem ser obtidas usando fluxos de trabalho típicos de proteômica de baixo para cima em que as proteínas são digeridas proteolíticos, fragmentos de peptídeos são separados por LC e locais modificados são identificados usando ms tandem (MS/MS). A rica história da química bioconjugada disponibilizou numerosos reagentes para experimentos cl-ms. Os reagentes CL se enquadram em duas categorias gerais: (i) específicas e (ii) não específicas. Reagentes específicos reagem com um único grupo funcional (por exemplo, aminas livres)8,10 e são fáceis de implementar, mas tendem a fornecer informações estruturais limitadas. Reagentes não específicos reagem com uma ampla gama de cadeias laterais, mas muitas vezes requerem equipamentos especializados, como lasers ou fontes síncrotrons para produzir essas espécies altamente reativas. Os radicais hidroxil são os reagentes não específicos mais utilizados, tendo sido aplicados em pegada radical hidroxil (HRF)7,11,12,13 experimentos para estudar uma ampla gama de proteínas e complexos proteicos sob uma variedade de condições.
Nosso grupo de pesquisa utilizou com sucesso outro reagente relativamente não específico chamado dietilpiroto (DEPC) para estudar estrutura proteica e interações no contexto dos experimentos cl-ms14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. O DEPC oferece a simplicidade de reagentes de rotulagem específicos (ou seja, nenhum equipamento especializado é necessário para realizar as reações), ao mesmo tempo em que reage com até 30% dos aminoácidos na proteína média. Como um reagente altamente eletrofílico, o DEPC é capaz de reagir com os resíduos n-terminus e as cadeias laterais nucleofílicas de cisteína, histidina, lise, tyrosina, serina e resíduos de threonina. Normalmente, um único produto dessas reações é gerado, resultando em um aumento em massa de 72,02 Da. Este único tipo de produto contrasta com os até 55 produtos diferentes que podem ser produzidos quando as proteínas reagem com radicais hidroxil7. Tal química simples facilita a identificação de locais rotulados.
Aqui, fornecemos protocolos para o uso do CL-MS baseado em DEPC para estudar estrutura e interações proteicas. Detalhes associados à preparação de reagentes, reações de proteínas DEPC, condições de digestão proteica, parâmetros LC-MS e MS/MS e análise de dados são descritos. Também demonstramos a utilidade da rotulagem DEPC, fornecendo exemplos de interações proteína-metal, proteína-ligante e proteína-proteína, bem como proteínas submetidas a mudanças estruturais após o aquecimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap RSLC C18 Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164537</td>
			<td>300 &#956;m x 15 cm, C18, 2 &#956;m, 100 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized chymotrypsin</td>
			<td>ProteoChem</td>
			<td>g4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry

Caracterizar a estrutura de alta ordem de uma proteína é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa (MS) emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar a estrutura de uma proteína por MS, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica as informações estruturais de uma proteína em sua massa. Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente cadeias laterais de aminoácidos acessíveis de solvente. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de diethylpirocarbonato (DEPC) como um reagente de rotulagem covalente juntamente com a detecção de MS. O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso junto com a MS para obter informações estruturais para pequenas proteínas de domínio único, como β2-microglobulina, para grandes proteínas multi-domínio, como anticorpos monoclonais.

Identificação de locais de modificação do DEPC e percentagens de modificação A adição em massa devido à rotulagem covalente pode ser medida nos (a) níveis de proteína intacta e (b) peptídeo8,9. No nível intacto, uma distribuição de espécies proteicas com diferentes números de rótulos pode ser obtida a partir de análise direta ou LC-MS de amostras de proteínas rotuladas. Para obter informações estruturais de maior resolução (ou ...

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Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Caracterizar uma estrutura proteica é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar uma estrutura proteica por espectro de massa, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica uma informação estrutural proteica em sua massa.Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente a resolução de cadeias laterais de aminoácidos acessíveis. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de pirocarbonato de dietilo ou DEPC como um reagente de rotulagem covalente, juntamente com a detecção de especificações de massa.O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso em conjunto com a especificação de massa para obter informações estruturais para muitas proteínas diferentes. Comece preparando uma solução tamponada de sua proteína de interesse em uma concentração na faixa de dezenas de micromolar.Nós geralmente usamos um tampão de 10 mililitros pH 7.4 MOPS. Alternativamente, uma solução proteica existente pode ser a troca de buffer em MOPS ou outro buffer se a amostra original contiver um buffer que tenha grupos funcionais nucleofílicos. É necessário que o tampão não tenha grupos funcionais nucleofílicos porque eles vão interferir com a reação proteica DEPC.Em um microtubo diferente, prepare uma solução de estoque de 100 mililitros DEPC em acetonitrilo seco. A preparação da solução de estoque em acetonitrila seca é necessária para evitar a hidrólise do DEPC. Em um novo microtubo, prepare a solução de um imidazol molar na água de grau HPLC.Em um novo microtubo, misture a solução de tampão MOPS e proteínas. À proteína e ao tampão adicione uma alíquota da solução de estoque DEPC certificando-se de que está misturando corretamente antes de colocar a mistura de reação em um banho de água de 37 graus Celsius por um minuto. O volume da solução de estoque DEPC que é utilizada deve ser escolhido com base na razão final de concentração de proteína DEPC desejada.Não há um conjunto de depc e concentrações proteicas que funcionarão com todas as proteínas, embora a concentração ideal de DEPC possa ser estimada com base no número de resíduos de histidina e liseina acessíveis de solvente presentes na proteína. Deve-se notar que o volume de acetonitrilo adicionado, que é efetivamente o volume da solução DEPC adicionado não deve exceder 1% do volume total de reação, a não ser para evitar perturbação da estrutura proteica durante a reação. O tempo de reação depende, em última análise, do usuário, embora uma reação de um minuto sob a condição de exemplo minimize a rotulagem da proteína e hidrólise do DEPC.Depois de um minuto se passou, sacia a reação adicionando o imidazol para resmemar o restante no DEPC reagido. Certificando-se de que a concentração final de imidazol é 50 vezes a concentração de DEPC. Para identificar os resíduos que foram modificados pelo DEPC, a proteína deve ser digerida proteolítico em fragmentos de peptídeos.Para a digestão, escolha condições que sejam favoráveis à proteína de interesse. As etapas comuns descritas aqui envolvem o desdobramento da proteína e, em seguida, a redução e alquilação de ligações de dissulfeto para que a eficiência de digestão possa ser melhorada. Em nossa experiência, o desdobramento da proteína com um denaturante e calor antes da digestão melhora a eficiência da digestão.Enquanto a proteína está sendo desdobrada, compare soluções de TCEP e iodoacetamida em um buffer de digestão apropriado. O TCEP deve ser usado como agente redutor em vez de dithiothreitol ou DTT porque o DTT pode reagir com resíduos modificados de DEPC. A alquilação dos arquivos resultantes após a redução é essencial para evitar a rotulagem em que arquivos livres e a proteína reagem com aminoácidos modificados.Uma vez terminado o passo de desdobramento, reduza as ligações de dissulfeto adicionando TCEP à mistura de reação e deixe-o reagir por três minutos à temperatura ambiente. Após a redução, adicione iodoacetamida à mistura de reação, deixe-a reagir por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Conseguido aqui colocando a mistura de reação em uma caixa.A concentração final de iodoacetamida deve ser o dobro da concentração utilizada para TCEP ou 80 vezes a concentração proteica ou ligação de dissulfeto. Prepare a enzima de interesse, geralmente trippsina ou chymotrypsina de acordo com as especificações do fabricante. Depois de preparar a enzima escolhida, comece a digestão e incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius.Uma relação proteína 10:1 para enzima com uma digestão de três horas usando enzimas imobilizadas é tipicamente uma boa escolha para proteínas rotuladas DEPC. Após a digestão, a amostra deve ser imediatamente analisada por LC-MS/MS ou flash congelado com nitrogênio líquido para minimizar a degradação da amostra e perda de rótulos. Os parâmetros padrão LC-MS/MS para proteômica de baixo para cima podem ser usados para identificar locais rotulados nos fragmentos de peptídeos protelíticos.A fase inversa C18 deve ser usada para alcançar a melhor separação dos peptídeos. Em nossa experiência, a LC capilar fornece informações quantitativas mais confiáveis sobre os níveis de modificação do que a nano LC devido às maiores quantidades de amostra utilizadas. Uma fase móvel típica da LC que é usada para separar peptídeos rotulados de DEPC é composta por dois solventes.Solvente A é água com ácido fórmico de 0,1% e solvente B é um acetonitrilo com ácido fórmico de 0,1%. É utilizada uma elução gradiente e o tempo de separação pode ser otimizado com base na complexidade da amostra. Um espectrômetro de massa capaz de fazer LC-MS e MS/MS on-line é necessário para identificar sites de modificação DEPC nos peptídeos.Em nossos experimentos, usamos com sucesso vários tipos de espectrômetros de massa. Descobrimos que uma Thermo Orbitrap Fusion fornece excelentes resultados, embora qualquer espectrômetro de massa capaz de realizar automaticamente MS/MS de muitos peptídeos durante uma análise LC-MS deve ser adequado. As condições do HPLC e os parâmetros espectrométricos de massa devem ser definidos adequadamente antes da medição.Se a amostra foi congelada, deve ser descongelada antes da análise. Tente o seu melhor para minimizar o tempo entre a preparação da amostra e a injeção de HPLC. Carregue e injete a amostra de proteína rotulada digerida no sistema LC e inicie a aquisição do LC-MS/MS ou a identificação do local do rótulo DEPC e a quantificação da área de pico, existem vários métodos.Em instrumentos Thermo Fisher, excalibur ou descobridor proteome talvez usado. Defina parâmetros apropriados para identificação de peptídeos em um programa. A adição de DEPC e carbamidometilação são incluídas como modificações variáveis auxiliando resíduos ou alocados.Áreas de pico cromatográficas de versões modificadas e não modificadas dos peptídeos são usadas para determinar percentagens de modificação do nível de resíduo. A rotulagem DEPC com detecção de MS também é uma ferramenta valiosa para caracterizar mudanças estruturais de ordem superior às proteínas. A partir do nosso estudo, a rotulagem covalente do DEPC pode identificar regiões proteicas específicas que sofrem alterações estruturais após o estresse térmico e oxidativo.Na figura, mudanças significativas nos percentuais de modificação são mostradas em azul para a diminuição da rotulagem e vermelho para o aumento da rotulagem, enquanto resíduos sem alterações significativas de rotulagem são mostrados em verde pálido. Por exemplo, após a microglobulina beta-2 ser exposta ao estresse térmico, muitos resíduos que sofrem quedas significativas nas extensões de rotulagem, N-terminus, serina 28, histidina 31, serina 33, serina 55, serina 57, e lysina 58 estão mais próximas de um lado da proteína sugerindo que esta região da proteína sofre uma mudança confirmacional ou possivelmente mediações de agregação. Após a proteína ser exposta ao estresse oxidativo, diferentes resíduos com diminuição na rotulagem, serina 11, histidina 13, lysina 19, lise 41 e lise 94 de um aglomerado em outra fase da proteína indicando que a oxidação induzida a alteração confirmacional ocorre em outros lugares.Este estudo tem implicações importantes para a terapêutica proteica, que atualmente é o segmento que mais cresce no mercado farmacêutico. Outros trabalhos do nosso grupo também mostraram que a especificação de massa de rotulagem covalente do DEPC pode detectar e identificar locais de alterações confirmacionais na terapêutica de anticorpos monoclonais estressados. Como você pode ver, a rotulagem covalente com DEPC é simples de implementar experimentalmente, mas pode fornecer informações estruturais valiosas para proteínas.A resolução estrutural fornecida pela especificação de massa de rotulagem DEPC é modesta quando comparada com as técnicas como cristalografia de raios-X e RMN, mas é aceitável para quase qualquer proteína, independentemente de seu tamanho ou capacidade de ser cristalizado. A especificação de massa de rotulagem covalente DEPC também trabalha com misturas proteicas e pode trabalhar com tipos de amostras muito complicadas, como o lise celular e as células haCat. Depois de assistir a este vídeo, estamos confiantes de que você encontrará a rotulagem DEPC como uma ferramenta útil para caracterizar a estrutura proteica.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Melhoria na Eliminação β Redutiva em Gel para Ligação O-Glicosídica e Sulfo-Glicômica Abrangente por Espectrometria de Massa.

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

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While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...