Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الروسية للبحوث الأساسية، منحة رقم 18-29-07002. وكان دعم P.K. من قبل الدولة تكليف وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم AAAA-A16-116021660073-5. تم دعم M.V.P. من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1659 (برنامج مركز كورشاتوف لبحوث الجينوم). وقد تم العمل جزئيا على المعدات التي تم شراؤها في إطار برنامج جامعة موسكو الحكومية للتنمية. I.C، S.L. و M.V.B بالإضافة إلى ذلك تم دعمها من قبل جامعة موسكو الحكومية منحة "المدرسة العلمية الرائدة سفينة نوح".

1. الخميرة إعداد الثقافة
<ol><li>خميرة متتالية من الثقافات المجمدة على لوحات جديدة مع المتوسطة المناسبة. وضع لوحات في حاضنة الثقافة في 30 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. ملاحظة: دع المسوخ الحساسة لدرجة الحرارة تنمو في درجة الحرارة المتساهلة.</li>
	<li>تلقيح الثقافات الخميرة في 2 مل من YPGal المتوسطة (2٪ pepton...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

تحتل تحقيقات التعبير الجيني جزءاً مركزياً في علوم الحياة الحديثة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب التي توفر رؤى في هذه العملية المعقدة. هنا، وصفنا الطريقة التي تسمح للوصول إلى البروتين في التركيب الحيوي خميرة بيكر S. cerevisiae الميتوكوندريا. وعادة ما يتم تطبيقه لمقارنة كفاءة الترجمة من mRN...

الميتوكوندريا هي العضيات المشاركة بعمق في عملية التمثيل الغذائي لخلايا النوى. وتزود سلسلة نقل الإلكترونات الخلية باستخدام ATP، وهي العملة النشطة الرئيسية المستخدمة في مسارات كيميائية حيوية متعددة. الى جانب ذلك ، فهي تشارك في موت الخلايا المبرمج ، والأحماض الدهنية والتوليف الهيم ، وغيرها من العمليات. الخلل في الميتوكوندريا هو مصدر معروف للمرض البشري1. يمكن أن تنتج عن الطفرات في الجينات النووية أو الميتوكوندريا ترميز المكونات الهيكلية أو التنظيمية من العضيات2. خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا لأسباب عدة. أولاً، يتم تسلسل الجينوم الخاص بهم بالكامل3، مشروح بشكل جيد ، وهناك مجموعة كبيرة من البيانات متوفرة بالفعل في الأدب بفضل التاريخ الطويل من التحقيقات التي أجريت مع هذا الكائن الحي. ثانياً، التلاعب بجينومهم النووي سريع نسبياً وسهل بسبب معدل نموها السريع ونظام إعادة التركيب المتماثل عالي الكفاءة. ثالثاً، خميرة بيكر S. cerevisiae هي واحدة من الكائنات الحية القليلة التي يتم تطوير التلاعب مع الجينوم الميتوكوندريا. وأخيرا ، خميرة بيكر هو كائن حي أيروب anaerobe الكليات ، والذي يسمح العزلة ودراسة المسوخ المعيبة في الجهاز التنفسي ، لأنها يمكن أن تنمو في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصادر الكربون القابلة للتخمير.
ونحن وصف طريقة لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا من خميرة بيكر S. cerevisiae في المستوى الترجمي4. ويأتي مبدأها الرئيسي من عدة ملاحظات. أولا ، فإن الجينوم الميتوكوندريا الخميرة ترميز ثمانية فقط من البروتينات : ثلاث وحدات فرعية من cytochrome c oxidase (Cox1p ، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج oxidoreductase انزيم، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوسومي الميتوكوندريا Var1p5. هذا العدد صغير، ويمكن فصل كل منهم بواسطة الكهرباء على هلام واحد في الظروف المناسبة. ثانيا، ينتمي الريبوسومات الميتوكوندريا إلى الطبقة prokaryotic بدلا من6eukaryotic ، وبالتالي ، فإن حساسية للمضادات الحيوية تختلف عن الريبوسومات السيتوبلازمية والخميرة الميتوكوندريا. فهو يسمح بتثبيط الترجمة السيتوبلاسميكية مع السيكلوهيكسيميIDE، وتوفير الظروف عندما يتم دمج الأحماض الأمينية المسماة(35S-methionine) فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، تعطي التجربة معلومات حول معدل دمج الأحماض الأمينية في بروتينات الميتوكوندريا التي تم تصنيعها في دي نوفو، مما يعكس الكفاءة الكلية لترجمة الميتوكوندريا لكل منتج من المنتجات الثمانية

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية من الخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. أنها تحتوي على الجينوم الدائري وأجهزة التعبير الجيني. جينوم الميتوكوندريا من خميرة الخباز يرمز ثمانية بروتينات: ثلاث وحدات فرعية من السيتوكروم سي أوكسيداز (Cox1p، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج إنزيم oxidoreductase، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوزوم الميتوكوندريا Var1p. الغرض من الطريقة المذكورة هنا هو تسمية هذه البروتينات على وجه التحديد مع 35S methionine، وفصلها عن طريق الكهرباء وتصور الإشارات كشرائط منفصلة على الشاشة. يتضمن الإجراء عدة خطوات. أولاً، يتم استزراع خلايا الخميرة في وسط يحتوي على الغالاكتوز حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخرة. بعد ذلك ، يمنع علاج cycloheximide الترجمة السيتوبلاسميك ويسمح بإدراج 35S methionine فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ثم يتم استخراج جميع البروتينات من خلايا الخميرة وفصلها بواسطة مادة الجل البولي أكرريلاميد الكهربائي. وأخيرا، يتم تجفيف هلام ومحتضنة مع شاشة الفوسفور التخزين. يتم مسح الشاشة على صورة فوسفورية تكشف عن العصابات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمقارنة معدل التركيب الحيوي لبوليبتيد واحد في الميتوكوندريا من سلالة الخميرة متحولة مقابل نوع البرية، وهو أمر مفيد لدراسة عيوب التعبير الجيني الميتوكوندريا. هذا البروتوكول يعطي معلومات قيمة حول معدل الترجمة لجميع mRNAs mRNS mitochondrial الخميرة. ومع ذلك، فإنه يتطلب العديد من الضوابط والتجارب الإضافية لجعل الاستنتاجات السليمة.

بعد البروتوكول المذكور أعلاه، قمنا بتعيين منتجات الترجمة الميتوكوندريا من اثنين من سلالات S. cerevisiae: النوع البرية (WT) وحذف تحمل متحولة من الجين AIM23 (AIM23Δ، ترميز عامل بدء الترجمة الميتوكوندريال 3 (الجدول 1)8. وقد تم تصنيف منتجات الترجمة الميتوكوندريا إش...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية للخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. خللهم الوظيفي هو مصدر معروف للأمراض البشرية. بيكر الخميرة الميتوكوندريا يحتوي على الجينوم الدائري ترميز ثمانية بروتينات.في هذا الفيديو، وصفنا البروتوكول المستخدم في فحص التمثيل الحيوي للبروتين في الميتوكوندريا الخميرة عن طريق وضع العلامات المشعة للمنتجات التحويلية والفصل اللاحق عن طريق إلكتروفورسيس هلام. يتضمن الإجراء عدة خطوات رئيسية. خميرة متتالية من ثقافات الأسهم المجمدة على لوحات طازجة مع المتوسط المناسب.وضع لوحات في حاضنة الثقافة في 30 درجة لمدة 24 إلى 48 ساعة. تلقيح هذه الثقافات في اثنين من ملليلتر من المتوسط من خط جديد في أنبوب 15 ملليلتر واحتضان لهم بين عشية وضحاها التحريض في 200 دورة في الدقيقة في 30 درجة. قياس الكثافة البصرية للثقافة عند الطول الموجي ل 600 نانومتر.تأخذ حجم المقابلة لوحدات امتصاص 0.2 في أنابيب معقمة لوحة خلايا الخميرة في 9, 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل هذا العملاق. غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان.خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق. تمييع الخلايا في اثنين من ملليلتر من مسح الطازجة agar المتوسطة.حافة الحضانة التي اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة حتى تصل الكثافة البصرية من 1.5 إلى 1.9 من 1.5 إلى 1.9 القيم. نقل حجم الثقافة المكافئ لوحدة بصرية واحدة في أنبوب الطرد المركزي الصغير. تدور الأنابيب في 3000 غرام لمدة دقيقة واحدة.تجاهل الناتنات الفائق. غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة تجاهل supernatant.إعادة تعليق خلايا الخميرة في 0.5 ملليلتر من العازلة الترجمة العقيمة. ضع التعليق في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة cycloheximide إلى تعليق الخلية تصل إلى التركيز النهائي من 0.2 ملليغرام لكل حضانة ملليلتر لمدة خمس دقائق الحافة التي اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة لمنع الترجمة الخلوية.إضافة من 25 إلى 30 إضافة من 25 إلى 30 ميكروكوري من S35 ميثيونين من S35 ميثيونين لتعليق الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة حافة اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة. إضافة methionine الباردة unlabeled وborymycin لوقف حضانة وضع العلامات لمدة 10 دقائق حافة اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة. جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 9، 000 G لمدة 30 ثانية.غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق.إضافة 75 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى لوحة دوامة لمدة خمس إلى 10 ثانية. إضافة 500 ميكرولتر من 0.5 الأضراس تريس العازلة من 0.5 الأضراس تريس العازلة مع pH 6.8. مع رقم الحموضة 6.8.دوامة لفترة وجيزة. إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. دوامة لمدة خمس ثوان.إضافة 150 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة. دوامة لمدة خمس ثوان. الطرد المركزي العينات لمدة دقيقتين في 12، 000 G.Carefully تجاهل opaface مع أخذ العينات.إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. مزيج بعناية عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. عينات الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 12،000 G.Discard supernatant.يجفف الهواء البالتات لمدة دقيقتين عند 80 درجة. حل البروتينات عجلت في 60 ميكرولتر من Laemmli عينة العازلة. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 14 درجة.السبب في هلام البولي أكريلاميد 17.5٪. تحميل 15 ميكرولتر من كل عينة في جيوب. تشغيل هلام في غرفة باردة حتى الصبغة الزرقاء تصل إلى ما يقرب من 65٪ من الليمفاوية هلام.وصمة عار الجل مع كوماسي الأزرق الرائعة وجعل المسح الضوئي أو الصورة التي هي مطلوبة كتحكم التحميل. جفف الجل في مجفف الجل. يبقيه في كاسيت مع شاشة تخزين الفوسفور لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام.مسح الشاشة على صور الفوسفور. بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، خصصنا منتجات ترجمة الميتوكوندريا من سلالات Saccharomyces cerevisiae. نوع البرية وحذف البديل متحولة من الجين Aim23 ترميز الميتوكوندريا عامل بدء الترجمة ثلاثة.تم بالفعل تسمية منتجات الترجمة الميتوكوندريا وفصلها بنشاط في هلام البولي أكريلاميد. تم جمع العينات كل دقيقتين ونصف قبل التشبع لبناء الدورة الزمنية. كان الجل ملطخا ومجففا ويتم فحصه بعد المعرض الذي أقيم لمدة خمسة أيام.في حالة تجربة ناجحة ، تظهر الصورة ثمانية نطاقات مخصصة وفقا للنمط القياسي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون كثافة النطاقات الفردية متغيرة للغاية اعتمادا على السلالة والظروف التجريبية. يتوافق كل نطاق مع منتج ترجمة واحد.وتشير البيانات إلى أن سلالة متحولة قادرة على تخليق البروتين الميتوكوندريا لأن جميع المنتجات التي تظهر في نوع البرية مرئية في هذا متحولة. ومع ذلك ، فإن كثافة العصابات تختلف عن النوع البري ، مما يعني أن هذا الحذف من Aim23 يؤثر على التعبير الجيني الميتوكوندريا. Kumasi تختمر في وصمة عار زرقاء وبمثابة عنصر تحكم التحميل.ويمكن قياس نتائجها في البيانات لتحديد الاختلافات بين السلالات أو الظروف التجريبية باستخدام صورة G أو صورة كوان البرمجيات. بالنسبة لهذه، يتم حساب نسبة الإشارة المقابلة لكل منتج إلى إجمالي الإشارة. يتم حساب متوسط القيم والانحرافات المعيارية في ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.تتم دراسة حركية البروتين المركب الذي تم تسليمها في تجربة العام الماضي. يتم جمع العينات في النقاط الزمنية المشار إليها بعد توقف رد فعل وضع العلامات عن طريق الميثيونين البارد والبوريميسين. عنصر التحكم هذا ضروري لتقدير استقرار المنتج.تلطيخ المناعة مع مكافحة بورين الأجسام المضادة واحد هو التحكم في التحميل. وصفنا هذه الطريقة، والتي غالبا ما تستخدم لدراسة التمثيل الحيوي البروتين في الميتوكوندريا الخميرة. هذا البروتوكول بسيط نسبيا وسريع الأداء.في الوقت نفسه، فإنه يسمح للحصول على معلومات قيمة حول معدل الترجمة من أربعة MRNAs الميتوكوندريا الخميرة، وهو أمر مفيد للغاية. ومع ذلك، لديها العديد من القيود التي تتطلب تجارب إضافية وتقع في هذه المستويات بين الولايات من البروتينات والرنانات. يمكن أن توفر المعلومات حول هذه الوظائف في نظام الترجمة الميتوكوندريا، ولكن ينبغي استخدام تقنيات أكثر تقدما لاكتشاف الآلية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

مقايسة السحب إلى جانب التعبير المشترك في خلايا البكتيريا كأداة فعالة من حيث الوقت لاختبار التفاعلات الصعبة بين البروتين والبروتين

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...