Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af den russiske Foundation for Basic Research, tilskud nummer 18-29-07002. P.K. blev støttet af statsopgaven for Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse, tilskudsnummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. blev støttet af Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse, tilskudsnummer 075-15-2019-1659 (Program of Kurchatov Center of Genome Research). Arbejdet blev delvist udført på det udstyr, der blev købt inden for rammerne af Moskva State University Program of Development. I.C., S.L., og M.V.B. blev desuden støttet af Moskva State University tilskud "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Gær kultur forberedelse
<ol><li>Streak gær fra den frosne bestand kulturer på friske plader med passende medium. Sæt pladerne i en dyrkningsinkubator ved 30 °C i 24-48 timer. BEMÆRK: Lad de temperaturfølsomme mutanter vokse ved den eftergivende temperatur.</li>
	<li>Pod gærkulturer i 2 mL YPGal medium (2% peptone, 1% gærekstrakt, 2% galactose) fra den friske stribe i 15 mL rør og inkuber dem natten over agiterende ved 200 rpm ved 30 °C.</li>
	<li>Den optiske tæthed af kulturen måles ved en bølgelæn...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

Undersøgelser af genekspression indtager en central rolle i moderne biovidenskab. Der er udviklet en lang række metoder, der giver indsigt i denne komplekse proces. Her beskrev vi den metode, der giver adgang til proteinbiosyntese i bagergær S. cerevisiae mitokondrier. Det er normalt anvendes til at sammenligne oversættelse effektivitetsgevinster af mRNA'er i mitokondrier af mutant gær stamme versus vilde type for at få adgang til konsekvenserne af den undersøgte mutation. Dette er et af de grundlæggende...

Mitokondrier er organellerne dybt involveret i metabolismen af en eukaryote celle. Deres elektronoverførselskæde forsyner cellen med ATP, den vigtigste energiske valuta, der bruges i flere biokemiske veje. Desuden er de involveret i apoptose, fedtsyre og hemesyntese og andre processer. Dysfunktion af mitokondrier er en velkendt kilde til menneskelig sygdom1. Det kan skyldes mutationer i nukleare eller mitokondriegener, der kodper strukturelle eller regulerende komponenter i organellerne2. Baker's gær Saccharomyces cerevisiae er en fremragende model organisme til at studere mitokondrie genekspression på grund af flere grunde. For det første er deres genom helt sekventeret3, godt kommenteret, og en stor sum data er allerede tilgængelig i litteraturen takket være den lange historie med undersøgelser udført med denne organisme. For det andet er manipulationerne med deres nukleare genom relativt hurtige og lette på grund af deres hurtige vækstrate og yderst effektive homologe rekombinationssystem. For det tredje er bagergær S. cerevisiae en af de få organismer, for hvilke manipulationerne med mitokondriegenomer udvikles. Endelig bagergær er en aerobe-anaerobe fakultetsorganisme, som tillader isolering og undersøgelse af respiratoriske defekte mutanter, da de kan vokse i medier, der indeholder fermenterbare kulstofkilder.
Vi beskriver metoden til at studere mitokondrie genekspression af bagergær S. cerevisiae på oversættelsesniveau4. Hovedprincippet kommer fra flere bemærkninger. For det første koder gæren mitokondriegenom kun otte proteiner: tre underenheder af cytochrom c oxidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheder af ATP synthase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhed af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase enzym, cytochrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p5. Dette tal er lille, og alle af dem kan adskilles ved elektroforese på en enkelt gel under passende forhold. For det andet tilhører mitokondrie ribosomer den prokaryote klasse snarere end eukaryote6, og derfor er følsomheden over for antibiotika anderledes for gærcytoplasmiske og mitokondrie ribosomer. Det gør det muligt at hæmme cytoplasmisk oversættelse med cykloheximid, hvilket giver betingelserne, når den mærkede aminosyre (35S-methionin) kun er indarbejdet i mitokondrieoversættelsesprodukter. Som følge heraf giver eksperimentet oplysninger om hastigheden af aminosyreinkorporering i mitokondrieproteiner syntetiseret de novo, hvilket afspejler den samlede effektivitet af mitokondrieoversættelse for hvert af de otte produkter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der er i stand til aerobt åndedræt. De indeholder cirkulært genom og genekspressionsapparat. Et mitokondriegenom af bagergær koder otte proteiner: tre underenheder af cytochrom c oxidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheder af ATP synthase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhed af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase enzym, cytochrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p. Formålet med den her beskrevne metode er specifikt at mærke disse proteiner med 35S methionin, adskille dem ved elektroforese og visualisere signalerne som diskrete bånd på skærmen. Proceduren omfatter flere trin. For det første dyrkes gærceller i et galactoseholdigt medium, indtil de når den sene logaritmiske vækstfase. Dernæst blokerer cykloheximidbehandling cytoplasmisk oversættelse og tillader kun 35S methionininkorporering i mitokondrieoversættelsesprodukter. Derefter udvindes alle proteiner fra gærceller og adskilles af polyacrylamidgelelektrophoresis. Endelig tørres gelen og inkuberes med opbevaringsfosforskærmen. Skærmen scannes på en fosformager, der afslører båndene. Metoden kan anvendes til at sammenligne biosyntesehastigheden af en enkelt polypeptid i mitokondrier af en mutant gærstamme i forhold til den vilde type, hvilket er nyttigt til at studere mitokondrie genekspressionsdefekter. Denne protokol giver værdifulde oplysninger om oversættelseshastigheden for alle gær mitokondrie mRNA'er. Det kræver dog flere kontroller og yderligere eksperimenter at drage ordentlige konklusioner.

Efter den ovenfor beskrevne protokol tildelte vi mitokondrieoversættelsesprodukter fra to S. cerevisiaestammer: den vilde type (WT) og en mutantbærende sletning af AIM23-genet (AIM23Δ), kodning af mitokondrieoversættelsesstartfaktor 3 (tabel 1)8. Mitokondrieoversættelsesprodukter blev radioaktivt mærket og adskilt i SDS-PAAG9. Prøverne blev indsamlet hver 2,5 min før mætning for at opbygge et tidsforløb(Figur 1A</s...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Bakers gær mitokondrie genom koder otte polypeptider. Målet med den aktuelle protokol er at mærke dem alle og efterfølgende visualisere dem som separate bånd.

Mærkning og visualisering af mitokondriegenomudtryksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der er i stand til aerobt åndedræt. Deres dysfunktion er en velkendt kilde til menneskelig sygdom. Bakers gær mitokondrier indeholder cirkulært genom kodning otte proteiner.I denne video beskrev vi den protokol, der anvendes til at analysere proteinbiosyntese i gær mitokondrier ved hjælp af radioaktiv mærkning af translationelle produkter og efterfølgende adskillelse ved gel elektroforese. Proceduren omfatter flere vigtige trin. Streak gær fra frosne bestand kulturer på friske plader med passende medium.Sæt pladerne i kulturinkubatoren ved 30 grader i 24 til 48 timer. Pod disse kulturer i to milliliter medium fra den friske stribe i en 15 milliliter rør og inkubere dem natten agiterende ved 200 RPM ved 30 grader. Mål kulturens optiske tæthed ved bølgelængden på 600 nanometer.Tag volumen svarende til 0,2 sugeevne enheder i sterile rør Palette gærceller på 9.000 G i 30 sekunder ved stuetemperatur. Kassér denne supernatant. Vask cellerne med 0,5 milliliter sterilt vand ved at hvirvle i fem sekunder.Pallette gærceller ved 9.000 G i 30 sekunder ved stuetemperatur. Kassér supernatanten. Fortynd celler i to milliliter frisk tørre agar medium.Inkuber kant taget ved 200 omdrejninger og 30 grader, indtil den optiske tæthed når fra 1,5 til 1,9 fra 1,5 til 1,9 værdier. Dyrkningsvolumen svarende til en optisk enhed overføres i mikrocentrifugerør. Drej rørene ved 3000 G i et minut.Kassér supernatanten. Vask cellerne med 0,5 milliliter sterilt vand ved at hvirvle i fem sekunder. Pallette gærceller ved 9.000 G i 30 sekunder ved stuetemperatur Kassér supernatanten.Ophæng gærcellerne igen i 0,5 milliliter steril oversættelsesbuffer. Affjedringen anbringes i 15 milliliterrør. Tilsæt cykloheximid til celleaffjedring op til den endelige koncentration på 0,2 milligram pr. milliliter Inkuber i fem minutters kant taget ved 200 RPM og 30 grader for at hæmme cytosolic oversættelse.Tilsæt fra 25 til 30 Tilføj fra 25 til 30 mikrocurie af S35 methionin af S35 methionin til celle suspension og inkuber i 30 minutter kant taget ved 200 RPM og 30 grader. Tilsæt umærket kold methionin og borymycin for at stoppe mærkningen Incubate i 10 minutters kant taget ved 200 RPM og 30 grader. Opsaml gærceller ved centrifugering ved 9.000 G i 30 sekunder.Vask cellerne med 0,5 milliliter sterilt vand ved at hvirvle i fem sekunder. Pallette gærceller ved 9.000 G i 30 sekunder ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.Tilføj 75 mikroliter lysis buffer til paletten og vortex i fem til 10 sekunder. Tilsæt 500 mikroliter på 0,5 molar tris buffer på 0,5 molar tris buffer med pH 6,8. Med pH 6,8.Vortex kort. Der tilsættes 600 mikroliter methanol til prøven. Vortex i fem sekunder.Der tilsættes 150 mikroliter kloroform til prøven. Vortex i fem sekunder. Prøverne centrifugeres i to minutter ved 12.000 G.Kassér forsigtigt opaface med en prøvetager.Der tilsættes 600 mikroliter methanol til prøven. Bland forsigtigt ved at vende røret flere gange. Centrifuge prøver i to minutter ved 12.000 G.Discard supernatant.Lufttørre pallette i to minutter ved 80 grader. Udfældede proteiner opløses i 60 mikroliter af Laemmli-prøvebufferen. Opvarm prøverne i 10 minutter ved 14 grader.Forårsage 17,5%Laemmli SDS polyacrylamid gel. Læg 15 mikroliter af hver prøve i lommerne. Kør gelen i kølerummet, indtil det blå farvestof når ca. 65% af gellymfeknuden.Plette gelen med Kumasi strålende blå og gøre scanning eller foto, som er påkrævet som lastning kontrol. Tør gelen i geltørreren. Opbevar den i kassetten med opbevaringsfosforskærm i tre til fem dage.Scan skærmen på fosforbillede. Efter den ovenfor beskrevne protokol tildelte vi mitokondrieoversættelsesprodukter fra to Saccharomyces cerevisiae-stammer. Den vilde type og mutant variant sletning af Aim23 gen kodning mitokondrie oversættelse indledning faktor tre.Mitokondrieoversættelsesprodukter var allerede aktivt mærket og adskilt i denaturerende polyacrylamidgel. Prøverne blev indsamlet hvert andet og et halvt minut før mætning for at opbygge tidsforløbet. Gelen blev farvet, tørret og screenet efter fem dages redegørelse.I tilfælde af et vellykket eksperiment demonstrerer billedet otte bånd, der er tildelt i henhold til standardmønsteret. Intensiteten af de enkelte bånd kan dog være meget varierende afhængigt af belastningen og forsøgsbetingelserne. Hvert bånd svarer til ét oversættelsesprodukt.Dataene tyder på, at den mutante stamme er i stand til mitokondrieproteinsyntese, fordi alle produkter, der forekommer i den vilde type, er synlige i denne mutant. Men intensiteten af båndene er forskellig fra den vilde type, hvilket betyder, at denne sletning af Aim23 påvirker mitokondriegenekspression. Kumasi brygget i blå plet og fungerer som en lastekontrol.Deres resultat i data kan kvantificeres for at identificere forskelle mellem stammer eller eksperimentelle tilstande ved hjælp af Image G- eller Image Quan-software. For disse beregnes forholdet mellem signalet svarende til hvert produkt og det samlede signal. Middelværdier og standardafvigelser beregnes i mindst tre uafhængige eksperimenter.Kinetik af syntetiseret protein vendt over studeres i et tidligere års eksperiment. Prøverne udtages på de angivne tidspunkter, efter at mærkningsreaktionen er standset af kold methionin og borymycin. Denne kontrol er nødvendig for at vurdere produktets stabilitet.Immuno-farvning med Anti-Porin et antistoffer er en lastning kontrol. Vi beskrev metoden, som ofte bruges til at studere proteinbiosyntese i gær mitokondrier. Denne protokol er relativt enkel og hurtig at udføre.Samtidig giver det mulighed for at få værdifulde oplysninger om oversættelseshastigheden af fire gær mitokondrie mRNA'er, hvilket er meget fordelagtigt. Men det har flere begrænsninger, der kræver yderligere eksperimenter og ligger i denne mellemstatslige niveauer af proteiner og mRNA'er. Det kan give oplysninger om disse funktioner i mitokondrieoversættelsessystem, men mere avancerede teknikker bør bruges til at opdage mekanismen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Udnyttelse af grafix til påvisning af forbigående interactorer af saccharomyces cerevisiae splejsning splejsstoffer

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse af neutral lipidsyntese i Saccharomyces cerevisiae ved metabolisk mærkning og tyndt lag kromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown-analyse kombineret med co-ekspression i bakterieceller som et tidseffektivt værktøj til test af udfordrende protein-protein-interaktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Billedbaseret kvantificering med høj kapacitet af mitokondrie-DNA-syntese og -distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

En forbedret metode til at isolere mitokondriekontaktsteder

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...