Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Russische Stichting voor Fundamenteel Onderzoek, subsidienummer 18-29-07002. P.K. werd ondersteund door staatsopdracht van het Ministerie van Wetenschappen en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidienummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidienummer 075-15-2019-1659 (Programma van Kurchatov Center of Genome Research). Het werk werd gedeeltelijk gedaan aan de apparatuur die werd gekocht in het kader van het Moscow State University Program of Development. I.C., S.L., en M.V.B. werden bovendien ondersteund door moscow state university grant "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Gistkweekbereiding
<ol><li>Streepgist uit de bevroren stamculturen op verse borden met het juiste medium. Doe de platen 24-48 uur in een kweekincubator bij 30 °C. OPMERKING: Laat de temperatuurgevoelige mutanten groeien bij de toegestane temperatuur.</li>
	<li>Ent gistculturen in 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gistextract, 2% galactose) uit de verse streep in 15 ml buizen en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 tpm bij 30 °C.</li>
	<li>Meet de optische dichtheid van de cultuur bij een golflengte van 600 nm (O...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

Onderzoeken naar genexpressie spelen een centrale rol in de moderne levenswetenschappen. Er zijn tal van methoden ontwikkeld die inzicht geven in dit complexe proces. Hier beschreven we de methode die toegang geeft tot eiwitbiosynthese in bakkersgist S. cerevisiae mitochondriën. Het wordt meestal toegepast om vertaalefficiënties van de mRNA's in mitochondriën van mutante giststam versus wild type te vergelijken om toegang te krijgen tot de gevolgen van de bestudeerde mutatie. Dit is een van de basisexperiment...

Mitochondriën zijn de organellen die nauw betrokken zijn bij het metabolisme van een eukaryotische cel. Hun elektronenoverdrachtsketen voorziet de cel van ATP, de belangrijkste energetische valuta die wordt gebruikt in meerdere biochemische paden. Bovendien zijn ze betrokken bij apoptose, vetzuur- en heemsynthese en andere processen. Disfunctie van mitochondriën is een bekende bron van menselijke ziekte1. Het kan het gevolg zijn van mutaties in nucleaire of mitochondriale genen die coderen voor structurele of regulerende componenten van organellen2. Baker's gist Saccharomyces cerevisiae is om verschillende redenen een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van mitochondriale genexpressie. Ten eerste is hun genoom vollediggesequentieerd 3, goed geannoteerd, en een grote som gegevens is al beschikbaar in de literatuur dankzij de lange geschiedenis van onderzoeken uitgevoerd met dit organisme. Ten tweede zijn de manipulaties met hun nucleaire genoom relatief snel en gemakkelijk vanwege hun snelle groeisnelheid en zeer efficiënt homologe recombinatiesysteem. Ten derde is bakkersgist S. cerevisiae een van de weinige organismen waarvoor de manipulaties met mitochondriale genomen zijn ontwikkeld. Ten slotte is bakkersgist een aerobe-anaerobe facultatief organisme, dat isolatie en studie van respiratoire defecte mutanten mogelijk maakt, omdat ze kunnen groeien in media die fermenteerbare koolstofbronnen bevatten.
We beschrijven de methode om mitochondriale genexpressie van bakkersgist S. cerevisiae op translationeel niveau 4 tebestuderen. Het belangrijkste principe komt uit verschillende observaties. Ten eerste codeert het gist mitochondriale genoom slechts acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p5. Dit aantal is klein en ze kunnen allemaal worden gescheiden door elektroforese op een enkele gel in de juiste omstandigheden. Ten tweede behoren mitochondriale ribosomen tot de prokaryotische klasse in plaats van eukaryotisch6, en daarom is de gevoeligheid voor antibiotica anders voor gistcytoplasmatische en mitochondriale ribosomen. Het maakt de remming van cytoplasmatische vertaling met cycloheximide mogelijk, op voorwaarde dat de omstandigheden waarin het gelabelde aminozuur (35S-methionine) alleen in mitochondriale vertaalproducten is opgenomen. Als gevolg hiervan geeft het experiment informatie over de snelheid van aminozuurincorporatie in mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd de novo, wat de algehele efficiëntie van mitochondriale vertaling voor elk van de acht producten weerspiegelt

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aërobe ademhaling. Ze bevatten cirkelvormige genoom- en genexpressieapparatuur. Een mitochondriaal genoom van bakkersgist codeert voor acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p. Het doel van de hier beschreven methode is om deze eiwitten specifiek te labelen met 35S methionine, ze te scheiden door elektroforese en de signalen te visualiseren als discrete banden op het scherm. De procedure omvat verschillende stappen. Ten eerste worden gistcellen gekweekt in een galactosebevattend medium totdat ze de late logaritmische groeifase bereiken. Vervolgens blokkeert cycloheximidebehandeling cytoplasmatische vertaling en staat 35S methionine-integratie alleen toe in mitochondriale vertaalproducten. Vervolgens worden alle eiwitten geëxtraheerd uit gistcellen en gescheiden door polyacrylamide gelelektroforese. Ten slotte wordt de gel gedroogd en geïncubeerd met het opslagfosforscherm. Het scherm wordt gescand op een fosforimager die de banden onthult. De methode kan worden toegepast om de biosynthesesnelheid van een enkel polypeptide in de mitochondriën van een mutante giststam te vergelijken met het wilde type, wat nuttig is voor het bestuderen van mitochondriale genexpressiedefecten. Dit protocol geeft waardevolle informatie over de vertaalsnelheid van alle gist mitochondriale mRNA's. Het vereist echter verschillende controles en aanvullende experimenten om goede conclusies te trekken.

Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee S. cerevisiae stammen: het wilde type (WT) en een mutante dragende deletie van het AIM23-gen (AIM23Δ), dat codeert voor mitochondriale vertalingsinitiatiefactor 3 (tabel 1)8. Mitochondriale vertaalproducten werden radioactief geëtiketteerd en gescheiden in SDS-PAAG9. De monsters werden elke 2,5 minuut vóór verzadiging verzameld om een tijd...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aerobe ademhaling. Hun disfunctie is een bekende bron van menselijke ziekten. Baker's gist mitochondriën bevat circulair genoom dat codeert voor acht eiwitten.In deze video beschreven we het protocol dat wordt gebruikt om eiwitbiosynthese in gist mitochondriën te analyseren door middel van radioactieve etikettering van translationele producten en daaropvolgende scheiding door gel-elektroforese. De procedure omvat verschillende belangrijke stappen. Streep gist uit bevroren stamculturen op verse borden met geschikt medium.Zet de platen 24 tot 48 uur op 30 graden in de kweekincubator. Ent deze culturen in twee milliliter medium uit de verse streep in een buis van 15 milliliter en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 RPM bij 30 graden. Meet de optische dichtheid van de cultuur op de golflengte van 600 nanometer.Neem het volume dat overeenkomt met 0,2 absorptie-eenheden in steriele buizen Palet gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi dit supernatant weg. Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen.Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Verdun cellen in twee milliliter vers veeg agar medium.Incubeer de rand bij 200 RPM en 30 graden totdat de optische dichtheid van 1,5 tot 1,9 van 1,5 tot 1,9 waarden bereikt. Breng het kweekvolume gelijk aan één optische eenheid in microcentrifugebuis over. Draai de buizen een minuut op 3000 G.Gooi het supernatant weg. Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen. Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur Gooi het supernatant weg.Schors gistcellen opnieuw in 0,5 milliliter steriele vertaalbuffer. Plaats de ophanging in een buis van 15 milliliter. Voeg cycloheximide toe aan celsuspensie tot de uiteindelijke concentratie van 0,2 milligram per milliliter Incubeer gedurende vijf minuten rand genomen bij 200 RPM en 30 graden om cytosolische vertaling te remmen.Voeg van 25 tot 30 Voeg van 25 tot 30 microcurie S35 methionine van S35 methionine toe aan celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten bij 200 RPM en 30 graden. Voeg ongelabelde koude methionine en borymycine toe om de etikettering te stoppen Incubeer gedurende 10 minuten rand genomen bij 200 RPM en 30 graden. Verzamel gistcellen door centrifugeren bij 9.000 G gedurende 30 seconden.Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen. Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.Voeg 75 microliters lysisbuffer toe aan het palet en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Voeg 500 microliters van 0,5 molaire tris buffer van 0,5 molaire tris buffer met pH 6,8 toe. Met een pH van 6,8.Vortex kort. Voeg 600 microliter methanol toe aan het monster. Vortex gedurende vijf seconden.Voeg 150 microliter chloroform toe aan het monster. Vortex gedurende vijf seconden. Centrifugeer de monsters gedurende twee minuten op 12,000 G.Gooi opaface voorzichtig weg met een sampler.Voeg 600 microliter methanol toe aan het monster. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren. Centrifugeer monsters gedurende twee minuten op 12,000 G.Discard supernatant.Droog de pallette twee minuten aan de lucht op 80 graden. Los neergeslagen eiwitten op in 60 microliters Laemmli-monsterbuffer. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 14 graden.Oorzaak van de 17,5%Laemmli SDS polyacrylamide gel. Steek 15 microliters van elk monster in de zakken. Voer de gel in de koude kamer totdat de blauwe kleurstof ongeveer 65% van de gellymfe bereikt.Beits de gel met Kumasi briljant blauw en maak een scan of foto die nodig is als laadcontrole. Droog de gel in de geldroger. Bewaar het drie tot vijf dagen in de cassette met opslagfosforscherm.Scan het scherm op phosphor imager. Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee Saccharomyces cerevisiae stammen. Het wilde type en de mutante variant deletie van het Aim23 gen dat codeert voor mitochondriale vertaling initiatie factor drie.Mitochondriale vertaalproducten werden al actief geëtiketteerd en gescheiden in de denatureren polyacrylamide gel. De monsters werden om de twee en een halve minuut voor verzadiging verzameld om de tijdsverloop op te bouwen. De gel werd bevlekt, gedroogd en gescreend na de vijfdaagse expositie.In het geval van een succesvol experiment toont het beeld acht banden die zijn toegewezen volgens het standaardpatroon. De intensiteiten van individuele banden kunnen echter zeer variabel zijn, afhankelijk van de stam en experimentele omstandigheden. Elke band komt overeen met één vertaalproduct.De gegevens suggereren dat de mutante stam in staat is tot mitochondriale eiwitsynthese omdat alle producten die in het wilde type verschijnen zichtbaar zijn in deze mutant. De intensiteiten van de banden verschillen echter van het wilde type, wat betekent dat deze deletie van Aim23 de mitochondriale genexpressie beïnvloedt. Kumasi gebrouwen in blauwe vlek en dient als laadcontrole.Hun resultaat in gegevens kan worden gekwantificeerd om verschillen tussen stammen of experimentele omstandigheden te identificeren met behulp van Image G- of Image Quan-software. Hiervoor wordt de verhouding van het signaal dat overeenkomt met elk product berekend op het totale signaal. Gemiddelde waarden en standaardafwijkingen worden berekend in ten minste drie onafhankelijke experimenten.De kinetiek van gesynthetiseerd eiwit wordt bestudeerd in een experiment van het afgelopen jaar. Monsters worden verzameld op de aangegeven tijdstippen nadat de etiketteringsreactie is gestopt door koude methionine en borymycine. Deze controle is nodig om de stabiliteit van het product te schatten.Immuno-kleuring met Anti-Porine één antilichamen is een ladingscontrole. We beschreven de methode, die vaak wordt gebruikt om eiwitbiosynthese in gist mitochondriën te bestuderen. Dit protocol is relatief eenvoudig en snel uit te voeren.Tegelijkertijd maakt het het mogelijk om waardevolle informatie te krijgen over de vertaalsnelheid van vier gist mitochondriale mRNAs, wat zeer voordelig is. Het heeft echter verschillende beperkingen die aanvullende experimenten vereisen en ligt in deze interstatelijke niveaus van eiwitten en mRNAs. Het kan de informatie over deze functies in mitochondriaal vertaalsysteem verstrekken, maar meer geavanceerde technieken moeten worden gebruikt om het mechanisme te ontdekken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...