Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cette recherche a été financée par la Fondation russe pour la recherche fondamentale, subvention numéro 18-29-07002. P.K. a été soutenu par l'Affectation d'État du Ministère des sciences et de l'enseignement supérieur de la Fédération de Russie, numéro de subvention AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. a été soutenu par le Ministère des sciences et de l'enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention numéro 075-15-2019-1659 (Programme de Kurchatov Center of Genome Research). Les travaux ont été réalisés en partie sur l'équipement acheté dans le cadre du Programme de développement de l'Université d'État de Moscou. I.C., S.L., et M.V.B. ont été en outre soutenus par la subvention de l'Université d'État de Moscou « Leading Scientific School Noah's Ark ».

1. Préparation de culture de levure
<ol><li>Streak levure des cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec le milieu approprié. Mettez les assiettes dans un incubateur de culture à 30 °C pendant 24-48 h. REMARQUE : Laissez pousser les mutants sensibles à la température à la température permissive.</li>
	<li>Inoculer les cultures de levure dans 2 mL de milieu YPGal (2% de peptone, 1% d'extrait de levure, 2% de galactose) de la strie fraîche dans des tubes de 15 mL et les incuber toute la n...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

Les études de l'expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d'accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l'efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéde...

Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d'une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d'électrons fournit à la cellule de l'ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l'apoptose, l'acide gras et la synthèse de l'hème, et d'autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites2. La levure saccharomyces cerevisiae de Baker est un excellent organisme modèle pour étudier l'expression des gènes mitochondriaux pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur génome estcomplètement séquencé 3, bien annoté, et une grande somme de données est déjà disponible dans la littérature grâce à la longue histoire des enquêtes menées avec cet organisme. Deuxièmement, les manipulations avec leur génome nucléaire sont relativement rapides et faciles en raison de leur taux de croissance rapide et de leur système de recombinaison homologue très efficace. Troisièmement, la levure de boulanger S. cerevisiae est l'un des rares organismes pour lesquels les manipulations avec des génomes mitochondriaux sont développées. Enfin, la levure de boulanger est un organisme de faculté d'aérobe-anaérobie, qui permet l'isolement et l'étude des mutants respiratoires défectueux, car ils peuvent se développer dans des médias contenant des sources de carbone fermentescibles.
Nous décrivons la méthode pour étudier l'expression mitochondrique de gène de la levure de boulanger S. cerevisiae au niveau translationnel4. Son principe principal provient de plusieurs observations. Tout d'abord, le génome mitochondrial de levure ne code que huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p5. Ce nombre est faible, et tous peuvent être séparés par électrophoresis sur un seul gel dans les conditions appropriées. Deuxièmement, les ribosomes mitochondriques appartiennent à la classe procaryotique plutôt qu'à l'eucaryotique6, et donc, la sensibilité aux antibiotiques est différente pour les ribosomes cytoplasmiques et mitochondriques de levure. Il permet l'inhibition de la traduction cytoplasmique avec le cycloheximide, fournissant les conditions où l'acide aminé étiqueté(35S-méthionine) est incorporé seulement dans les produits de traduction mitochondrial. En conséquence, l'expérience donne des informations sur le taux d'incorporation d'acides aminés dans les protéines mitochondriales synthétisées de novo, reflétant l'efficacité globale de la traduction mitochondriale pour chacun des huit produits

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d'expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d'étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine 35S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l'écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d'abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ne permet l'incorporation de 35S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l'écran de phosphore de stockage. L'écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d'un seul polypeptide dans les mitochondries d'une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d'expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrique à partir de deux souches de S. cerevisiae : le type sauvage (WT) et une suppression mutante du gène AIM23 (AIM23Δ), codant le facteur d'initiation à la traduction mitochondrique 3 (tableau 1)8. Les produits de traduction mitochondrial ont été étiquetés et séparés radioactivement dans SDS-PAAG9. Les échantillons ont été prélevés t...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.

Étiquetage et visualisation des produits d&apos;expression du génome mitochondrial dans Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Leur dysfonctionnement est une source bien connue de maladie humaine. Les mitochondries de levure de Baker contiennent un génome circulaire codant huit protéines.Dans cette vidéo, nous avons décrit le protocole utilisé pour l’analyse de la biosynthèse protéique dans les mitochondries de levure au moyen de l’étiquetage radioactif des produits translationnels et de la séparation subséquente par électrophoresis gel. La procédure comprend plusieurs étapes majeures. Streak levure de cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec un milieu approprié.Mettez les assiettes dans l’incubateur de culture à 30 degrés pendant 24 à 48 heures. Inoculer ces cultures en deux millilitres de milieu de la strie fraîche dans un tube de 15 millilitres et les incuber pendant la nuit agitant à 200 RPM à 30 degrés. Mesurer la densité optique de la culture à la longueur d’onde de 600 nanomètres.Prenez le volume correspondant à 0,2 unités d’absorption dans les cellules de levure palette tubes stériles à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jetez ce supernatant. Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes.Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnatant. Diluer les cellules en deux millilitres de linge frais moyen d’agar.Bord d’incubation pris à 200 RPM et 30 degrés jusqu’à ce que la densité optique atteigne de 1,5 à 1,9 de 1,5 à 1,9 valeurs. Transférer le volume de culture équivalent à une unité optique dans un tube de micro centrifugeuse. Faire tourner les tubes à 3000 G pendant une minute.Jeter le surnatant. Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes. Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante Jeter le supernatant.Suspendre à nouveau les cellules de levure dans 0,5 millilitres de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 millilitres. Ajouter le cycloheximide à la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre d’incubation pendant cinq minutes de bord pris à 200 RPM et 30 degrés pour inhiber la traduction cytosolique.Ajouter de 25 à 30 Ajouter de 25 à 30 microcourards de méthionine S35 de la méthionine S35 à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 minutes bord pris à 200 RPM et 30 degrés. Ajouter la méthionine froide non étiquetée et la borymycine pour arrêter l’étiquetage Incubate pendant 10 minutes bord pris à 200 RPM et 30 degrés. Recueillir les cellules de levure par centrifugation à 9000 G pendant 30 secondes.Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes. Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnatant.Ajouter 75 microlitres de tampon de lyse à la palette et au vortex pendant cinq à dix secondes. Ajouter 500 microlitres de 0,5 molar tris tampon de 0,5 molaire tris tampon avec pH 6,8. Avec pH 6.8.Vortex brièvement. Ajouter 600 microlitres de méthanol à l’échantillon. Vortex pendant cinq secondes.Ajouter 150 microlitres de chloroforme à l’échantillon. Vortex pendant cinq secondes. Centrifugeuse les échantillons pendant deux minutes à 12 000 G.Jetez soigneusement l’opaface avec un échantillonneur.Ajouter 600 microlitres de méthanol à l’échantillon. Mélanger soigneusement en inversant le tube plusieurs fois. Centrifugeuses pendant deux minutes à 12 000 G.Jeter le supernatant.Sécher à l’air le palettisation pendant deux minutes à 80 degrés. Dissoudre les protéines précipitées dans 60 microlitres de tampon échantillon Laemmli. Chauffer les échantillons pendant 10 minutes à 14 degrés.Causer le gel polyacrylamide SDS 17,5%Laemmli. Charger 15 microlitres de chaque échantillon dans les poches. Faire fonctionner le gel dans la chambre froide jusqu’à ce que le colorant bleu atteigne environ 65% de la lymphe gel.Tachez le gel avec kumasi bleu brillant et faire l’analyse ou la photo qui est nécessaire comme contrôle de chargement. Sécher le gel dans le séchoir à gel. Gardez-le dans la cassette avec écran de phosphore de stockage pendant trois à cinq jours.Numérisez l’écran sur l’imageur de phosphore. Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrial de deux souches de Cerevisiae de Saccharomyces. Le type sauvage et la suppression de variante mutante du gène Aim23 codant le facteur d’initiation mitochondrique de traduction trois.Les produits de traduction mitochondrial étaient déjà activement étiquetés et séparés dans le gel de polyacrylamide dénaturant. Les échantillons ont été prélevés toutes les deux minutes et demie avant la saturation pour construire le cours du temps. Le gel a été taché, séché et filtré après l’exposition de cinq jours.Dans le cas d’une expérience réussie, l’image montre huit bandes assignées selon le modèle standard. Cependant, les intensités des bandes individuelles peuvent être très variables selon la souche et les conditions expérimentales. Chaque bande correspond à un produit de traduction.Les données suggèrent que la souche mutante est capable de synthèse des protéines mitochondriales parce que tous les produits apparaissant dans le type sauvage sont visibles dans ce mutant. Cependant, les intensités des bandes sont différentes du type sauvage, ce qui signifie que cette suppression d’Aim23 affecte l’expression du gène mitochondrial. Kumasi brassé en tache bleue et sert de contrôle de chargement.Leur résultat en données peut être quantifié pour identifier les différences entre les souches ou les conditions expérimentales à l’aide du logiciel Image G ou Image Quan. Pour ceux-ci, le rapport du signal correspondant à chaque produit est calculé au signal total. Les valeurs moyennes et les écarts types sont calculés dans au moins trois expériences indépendantes.La cinétique des protéines synthétisées retournées est étudiée au cours d’une expérience de l’année écoulée. Les échantillons sont prélevés aux points de temps indiqués après l’arrêt de la réaction d’étiquetage par la méthionine froide et la borymycine. Ce contrôle est nécessaire pour estimer la stabilité du produit.Immuno-coloration avec anti-porine un anticorps est un contrôle de chargement. Nous avons décrit la méthode, qui est souvent utilisée pour étudier la biosynthèse protéique dans les mitochondries de levure. Ce protocole est relativement simple et rapide à exécuter.Dans le même temps, il permet d’obtenir des informations précieuses sur le taux de traduction de quatre aDRM mitochondriaux de levure, ce qui est très avantageux. Cependant, il a plusieurs limitations nécessitant des expériences supplémentaires et se trouve dans ces niveaux interétatiques de protéines et d’ARNM. Il peut fournir des informations sur ces fonctions dans le système de traduction mitochondrial, mais des techniques plus avancées devraient être utilisées pour découvrir le mécanisme.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Recherche

Biochimie

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Évaluation de la localisation des protéines submitochondriales dans la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...