Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי הקרן הרוסית למחקר בסיסי, מענק מספר 18-29-07002. P.K. נתמך על ידי הקצאת המדינה של משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מספר מענק AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. נתמך על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מספר 075-15-2019-1659 (תוכנית מרכז Kurchatov לחקר הגנום). העבודה נעשתה בחלקה על הציוד שנרכש במסגרת תוכנית הפיתוח של אוניברסיטת מוסקבה. I.C., S.L., ו M.V.B נתמכו בנוסף על ידי אוניברסיטת מוסקבה סטייט מענק "בית הספר המדעי המוביל תיבת נח".

1. הכנת תרבות שמרים
<ol><li>שמרים פס מתרבויות מלאי קפוא על צלחות טריות עם המדיום המתאים. שים את הצלחות באינקובטור תרבות ב 30 מעלות צלזיוס עבור 24-48 שעות. הערה: תן למוטנטים הרגישים לטמפרטורה לגדול בטמפרטורה המתירנית.</li>
	<li>לחסן תרביות שמרים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal (2% פפטון, 1% תמצית שמרים, 2% גלקטוז) מן ה?...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

חקירות של ביטוי גנים תופסות חלק מרכזי במדעי החיים המודרניים. פותחו שיטות רבות המספקות תובנות על תהליך מורכב זה. כאן, תיארנו את השיטה המאפשרת גישה לביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה S. cerevisiae של בייקר. זה מיושם בדרך כלל כדי להשוות יעילות תרגום של mRNAs במיטוכונדריה של זן שמרים מוטנטים לעומ...

המיטוכונדריה הם אברונים מעורבים עמוק בחילוף החומרים של תא אוקריוטי. שרשרת העברת האלקטרונים שלהם מספקת לתא ATP, המטבע האנרגטי העיקרי המשמש במסלולים ביוכימיים מרובים. חוץ מזה, הם מעורבים אפופטוזיס, חומצת שומן סינתזה heme, ותהליכים אחרים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מקור ידוע של מחלה אנושית1. זה יכול לנבוע מוטציות בגנים גרעיניים או מיטוכונדריאליים קידוד רכיבים מבניים או רגולטוריים של organelles2. שמרי בייקר Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר ביטוי גנים מיטוכונדריאלי בשל מספר סיבות. ראשית, הגנום שלהם רצף לחלוטין3, מבואר היטב, וסכום גדול של נתונים כבר זמין בספרות הודות להיסטוריה הארוכה של חקירות שבוצעו עם האורגניזם הזה. שנית, המניפולציות עם הגנום הגרעיני שלהם הן מהירות וקלות יחסית בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם ומערכת רקומביניזציה הומולוגית יעילה מאוד. שלישית, שמרי האופה S. cerevisiae הוא אחד האורגניזמים הבודדים שעבורם המניפולציות עם הגנום המיטוכונדריאלי מפותחות. לבסוף, שמרי האופה הוא אורגניזם פקולטטיבי אווירוב-אנארוב, המאפשר בידוד וחקר של מוטציות פגומות בדרכי הנשימה, שכן הם יכולים לגדול במדיה המכילה מקורות פחמן מותססים.
אנו מתארים את השיטה ללמוד ביטוי גנים מיטוכונדריאלי של שמרי אופה S. cerevisiae ברמה התרגומית4. העיקרון העיקרי שלה מגיע מכמה תצפיות. ראשית, הגנום המיטוכונדריאלי של השמרים מקודד רק שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p5. מספר זה קטן, וניתן להפריד את כולם על ידי אלקטרופורזה על ג'ל יחיד בתנאים המתאימים. שנית, ריבוזומים מיטוכונדריאליים שייכים למעמד הפרוקריוטי ולא לאוקריוטיקה6, ולכן הרגישות לאנטיביוטיקה שונה עבור ריבוזומים ציטופלזמים ומיטוכונדריאליים. זה מאפשר עיכוב של תרגום ציטופלסמי עם ציקלוהקסימיד, מתן התנאים כאשר חומצת אמינו שכותרתו(35S-מתיונין) משולב רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, הניסוי מספק מידע על קצב שילוב חומצות האמינו בחלבונים המיטוכונדריים מסונתז דה נובו, המשקף את היעילות הכוללת של תרגום מיטוכונדריאלי עבור כל אחד משמונת המוצרים

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. הם מכילים גנום מעגלי ומנגנון ביטוי גנים. גנום מיטוכונדריאלי של שמרי אופה מקודד שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p. מטרת השיטה המתוארת כאן היא לתייג במיוחד חלבונים אלה עם 35S methionine, להפריד אותם על ידי אלקטרופורזה לדמיין את האותות כמו להקות נפרדות על המסך. ההליך כרוך במספר שלבים. ראשית, תאי שמרים מתרבתים במדיום המכיל גלקטוז עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר. לאחר מכן, טיפול ציקלוהקסימיד חוסם תרגום ציטופלסמי ומאפשר 35S שילוב מתיון רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, כל החלבונים מופקים מתאי שמרים ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד. לבסוף, הג'ל מיובש ומדגיר עם מסך זרחן האחסון. המסך נסרק על זרחן החושף את הלהקות. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעור הביוסינתזה של פוליפפטיד יחיד במיטוכונדריה של זן שמרים מוטציה לעומת סוג הבר, אשר שימושי לחקר פגמים ביטוי גנים מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מספק מידע רב ערך על קצב התרגום של כל mRNAs המיטוכונדריה שמרים. עם זאת, הוא דורש מספר בקרות וניסויים נוספים כדי להסיק מסקנות נכונות.

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זני S. cerevisiae: סוג הבר (WT) ומוטנט הנושא מחיקה של הגן AIM23 (AIM23Δ), קידוד גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי 3 (טבלה 1)8. מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי סומנו באופן רדיואקטיבי והופרדו ב- SDS-PAAG9. הדגימ...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. תפקודם הלקוי הוא מקור ידוע למחלה אנושית. המיטוכונדריה של שמרי בייקר מכילה קידוד גנום עגול שמונה חלבונים.בסרטון זה, תיארנו את הפרוטוקול המשמש לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים באמצעות תיוג רדיואקטיבי של מוצרים תרגומיים והפרדה עוקבת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. ההליך כולל מספר שלבים עיקריים. שמרים פסים מתרבויות מלאי קפואות על צלחות טריות עם מדיום מתאים.שים את הצלחות באינקובטור התרבות ב 30 מעלות במשך 24 עד 48 שעות. לחסן תרבויות אלה בשני מיליליטרים של מדיום מן הפס הטרי בצינור 15 מיליליטר ולהדגיר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 מעלות. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך הגל של 600 ננומטר.קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בתאי שמרים פלטת צינורות סטריליים ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט הזה. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות.תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט. לדלל תאים בשני מיליליטר של מדיום אגר ניגוב טרי.קצה הדגירה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות עד הצפיפות האופטית מגיע מ 1.5 ל 1.9 מ 1.5 עד 1.9 ערכים. העבר את נפח התרבות שווה ערך ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרו צנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב3000 G לדקה אחת.השלך את הסופרנט. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר להשליך את supernatant.להשעות מחדש את תאי השמרים ב 0.5 מיליליטר של מאגר תרגום סטרילי. מניחים את ההשעיה בצינור 15 מיליליטר. הוסף ציקלוהקסימיד להשעיית תאים עד ריכוז סופי של 0.2 מיליגרם לכל דגירה מיליליטר במשך חמש דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות כדי לעכב תרגום ציטוזולי.הוסף מ 25 כדי 30 להוסיף מ 25 כדי 30 מיקרוקורי של S35 מתונין של S35 מתונין כדי התא השעיה דגירה במשך 30 דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות. הוסף מתונין קר ללא תווית ו borymycin להפסיק את הדגירה תיוג במשך 10 דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות. לאסוף תאי שמרים על ידי צנטריפוגה ב 9, 000 G במשך 30 שניות.לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט.הוסף 75 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לפלטה ומערבולת במשך חמש עד 10 שניות. הוסף 500 מיקרוליטרים של 0.5 חוצץ tris טוחנת של 0.5 חוצץ tris טוחנת עם pH 6.8. עם pH 6.8.וורטקס לזמן קצר. הוסף 600 מיקרוליטרים של מתנול לדגימה. וורטקס לחמש שניות.הוסף 150 מיקרוליטרים של כלורופורם לדגימה. וורטקס לחמש שניות. צנטריפוגה הדגימות במשך שתי דקות ב 12, 000 G.בזהירות להשליך opaface עם סמפלר.הוסף 600 מיקרוליטרים של מתנול לדגימה. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגימות צנטריפוגה במשך שתי דקות ב12, 000 G. להשליך supernatant.אוויר לייבש את הפלט במשך שתי דקות ב 80 מעלות. ממיסים חלבונים מזורזים ב-60 מיקרוליטרים של מאגר מדגם לאמלי. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 14 מעלות.סיבה 17.5% Laemmli SDS פוליאקרילמיד ג'ל. טען 15 מיקרוליטרים של כל דגימה בכיסים. הפעל את הג'ל בחדר הקר עד הצבע הכחול מגיע כ 65% של הלימפה ג'ל.הכתים את הג'ל בכחול מבריק של קומאסי ובצע סריקה או תמונה הנדרשת כבקרת טעינה. יבש את הג'ל במייבש הג'ל. שמור אותו בקלטת עם מסך זרחן אחסון במשך שלושה עד חמישה ימים.סרוק את המסך על תמונה זרחנית. בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זנים Saccharomyces cerevisiae. הסוג הפראי ומחיקת וריאנט המוטנטים של קידוד הגן Aim23 גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי שלוש.מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי כבר סומנו באופן פעיל והופרדו בג'ל פוליאקרילמיד דנאטורי. הדגימות נאספו כל שתיים וחצי דקות לפני הרוויה כדי לבנות את מסלול הזמן. הג'ל היה מוכתם, מיובש ומוקרן לאחר התערוכה בת חמשת הימים.במקרה של ניסוי מוצלח, התמונה מדגימה שמונה להקות שהוקצו על פי התבנית הסטנדרטית. עם זאת, העוצמות של להקות בודדות יכולות להיות משתנות מאוד בהתאם למתח ולתנאים הניסיוניים. כל להקה מתאימה למוצר תרגום אחד.הנתונים מצביעים על כך שזן המוטנטים מסוגל לסינתזת חלבונים מיטוכונדריאליים מכיוון שכל המוצרים המופיעים בסוג הפראי נראים במוטנט זה. עם זאת, העוצמות של הלהקות שונות מהסוג הפראי, כלומר מחיקה זו של Aim23 משפיעה על ביטוי הגן המיטוכונדריאלי. קומאסי מבושל בכתם כחול ומשמש כבקרת טעינה.ניתן לכמת את התוצאה שלהם בנתונים כדי לזהות הבדלים בין זנים או תנאים ניסיוניים באמצעות תוכנת Image G או Image Quan. עבור אלה, היחס בין האות המתאים לכל מוצר מחושב לאות הכולל. ערכים ממוצעים וסטיות תקן מחושבים בשלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.הקינטיקה של חלבון מסונתז שהתהפך נחקרת בניסוי שנערך בשנה שעברה. דגימות נאספות בנקודות הזמן שצוינו לאחר תגובת התיוג נעצרת על ידי מתיונין קר ו borymycin. בקרה זו נחוצה כדי להעריך את יציבות המוצר.מכתים אימונים עם נוגדנים נגד פורין אחד הוא בקרת טעינה. תיארנו את השיטה, המשמשת לעתים קרובות לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים. פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית ומהיר לביצוע.במקביל, הוא מאפשר לקבל מידע רב ערך על שיעור התרגום של ארבעה שמרים מיטוכונדריאלי mRNAs, וזה יתרון מאוד. עם זאת, יש לו מספר מגבלות הדורשות ניסויים נוספים טמון זה רמות interstate של חלבונים mRNAs. זה יכול לספק את המידע על פונקציות אלה במערכת תרגום מיטוכונדריאלי, אבל טכניקות מתקדמות יותר יש להשתמש כדי לגלות את המנגנון.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...