Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

इस शोध को रूसी फाउंडेशन फॉर बेसिक रिसर्च, ग्रांट नंबर 18-29-07002 द्वारा वित्त पोषित किया गया था । पीके को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय के राज्य असाइनमेंट, अनुदान संख्या एए-ए16-116021660073-5 द्वारा समर्थित किया गया था । M.V.P. को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान संख्या 075-15-2019-1659 (कुचतोव सेंटर ऑफ जीनोम रिसर्च का कार्यक्रम)। काम आंशिक रूप से विकास के मास्को राज्य विश्वविद्यालय कार्यक्रम के फ्रेम में खरीदा उपकरणों पर किया गया था । I.C, S.L., और M.V..B अतिरिक्त मास्को राज्य विश्वविद्यालय अनुदान "अग्रणी वैज्ञानिक स्कूल नूह के संदूक" द्वारा समर्थित थे ।

1. खमीर संस्कृति की तैयारी
<ol><li>उपयुक्त माध्यम के साथ ताजा प्लेटों पर जमे हुए स्टॉक संस्कृतियों से लकीर खमीर। प्लेटों को 24-48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। नोट: तापमान के प्र?...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

जीन अभिव्यक्ति की जांच आधुनिक जीवन विज्ञान में एक केंद्रीय भाग पर कब्जा । इस जटिल प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले कई तरीके विकसित किए गए हैं। यहां, हमने बेकर के खमीर एस सेरेविसिया माइटो?...

माइटोकॉन्ड्रिया एक यूकेरियोटिक सेल के मेटाबोलिज्म में गहराई से शामिल ऑर्गेनेल्स हैं। उनकी इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर चेन एटीपी के साथ सेल की आपूर्ति करती है, जो कई जैव रासायनिक रास्तों में उपयोग की जाने वाली मुख्य ऊर्जावान मुद्रा है। इसके अलावा, वे एपोप्टोसिस, फैटी एसिड और हेम संश्लेषण, और अन्य प्रक्रियाओं में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रिया की शिथिलता मानव रोग का एक प्रसिद्ध स्रोत है1. इसके परिणामस्वरूप नाभिकीय या माइटोकॉन्ड्रियल जीन में म्यूटेशन हो सकता है जो ऑर्गेनेल्स2के संरचनात्मक या नियामक घटकों को एन्कोडिंग करते हैं । बेकर का खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया कई कारणों से माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। सबसे पहले, उनके जीनोम पूरी तरह सेअनुक्रम 3,अच्छी तरह से एनोटेटेड है, और डेटा का एक बड़ा योग पहले से ही इस जीव के साथ किए गए जांच के लंबे इतिहास के लिए धंयवाद साहित्य में उपलब्ध है । दूसरा, उनके परमाणु जीनोम के साथ जोड़तोड़ अपेक्षाकृत तेज और उनकी तेजी से विकास दर और अत्यधिक कुशल अनुरूप पुनर्संयोजन प्रणाली की वजह से आसान कर रहे हैं । तीसरा, बेकर का खमीर एस सेरेविसिया उन कुछ जीवों में से एक है जिनके लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम के साथ जोड़तोड़ विकसित किए जाते हैं। अंत में, बेकर का खमीर एक एरोब-एनारोब संकाय जीव है, जो श्वसन दोषपूर्ण म्यूटेंट के अलगाव और अध्ययन की अनुमति देता है, क्योंकि वे किण्वित कार्बन स्रोतों वाले मीडिया में विकसित हो सकते हैं।
हम ट्रांसलेशनल स्तर 4 पर बेकर के खमीर एस सेरेविसिया की माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की विधि का वर्णन करतेहैं। इसका मुख्य सिद्धांत कई टिप्पणियों से आता है। सबसे पहले, खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम केवल आठ प्रोटीन को एन्कोड करता है: साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस (कॉक्स 1प, के तीन उपइकाइट्स कॉक्स 2पी, और कॉक्स 3पी), एटीपी सिंथेस (Atp6p, Atp8p, और Atp9p), ubiquinol-cytochrome c ऑक्सीडोरेक्टेज एंजाइम, साइटोक्रोम बी (Cytb), और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल प्रोटीन Var1p5की एक उपइकांत । यह संख्या छोटी है, और उन सभी को उचित परिस्थितियों में एक ही जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जा सकता है। दूसरा, माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम यूकेरियोटिक6के बजाय प्रोकैरियोटिक वर्ग से संबंधित हैं, और इसलिए, एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशीलता खमीर साइटोप्लाज्मिक और माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम्स के लिए अलग है। यह साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ साइटोप्लाज्मिक अनुवाद के अवरोध की अनुमति देता है, जब लेबल किए गए अमीनो एसिड(35एस-मेथियोनिन) को केवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों में शामिल किया जाता है। नतीजतन, प्रयोग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषित डी नोवो में अमीनो एसिड निगमन की दर के बारे में जानकारी देता है, जो आठ उत्पादों में से प्रत्येक के लिए माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की समग्र दक्षता को दर्शाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

माइटोकॉन्ड्रिया एरोबिक श्वसन में सक्षम यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक ऑर्गेनेल्स हैं। इनमें गोलाकार जीनोम और जीन अभिव्यक्ति उपकरण होते हैं। बेकर के खमीर का एक माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम आठ प्रोटीन को एन्कोड करता है: साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस (कॉक्स1पी, के तीन उपइकाइट्स कॉक्स 2पी, और कॉक्स 3पी), एटीपी सिंथेस (Atp6p, Atp8p, और Atp9p), ubiquinol-cytochrome c ऑक्सीडोरेक्टेज एंजाइम, साइटोक्रोम बी (Cytb), और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल प्रोटीन Var1p की एक उपइकांत । यहां वर्णित विधि का उद्देश्य विशेष रूप से इन प्रोटीनों को 35एस मेथियोनिन के साथ लेबल करना है, उन्हें इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग करना और स्क्रीन पर असतत बैंड के रूप में संकेतों की कल्पना करना है। प्रक्रिया में कई कदम शामिल हैं। सबसे पहले, खमीर कोशिकाओं को एक गैलेक्टोज युक्त माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जब तक कि वे देर से लॉगरिथम विकास चरण तक नहीं पहुंच जाते। इसके बाद, साइक्लोहेक्सिमाइड उपचार साइटोप्लाज्मिक अनुवाद को अवरुद्ध करता है और केवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों में 35एस मेथियोनिन निगमन की अनुमति देता है। फिर, सभी प्रोटीन खमीर कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए जाते हैं। अंत में, जेल को सूखे और भंडारण फॉस्फोर स्क्रीन के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। बैंड का खुलासा करने वाले फॉस्फोरमगर पर स्क्रीन को स्कैन किया जाता है। विधि को जंगली प्रकार बनाम उत्परिवर्ती खमीर तनाव के माइटोकॉन्ड्रिया में एक एकल पॉलीपेप्टाइड की बायोसिंथेसिस दर की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति दोषों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। यह प्रोटोकॉल सभी खमीर माइटोकॉन्ड्रियल mRNAs के अनुवाद दर के बारे में मूल्यवान जानकारी देता है। हालांकि, उचित निष्कर्ष निकालने के लिए कई नियंत्रणों और अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता होती है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने दो एस सेरेविसिया उपभेदों से माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों को सौंपा: जंगली प्रकार(डब्ल्यूटी)और AIM23 जीन(AIM23,एन्कोडिंग माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद दीक्...

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Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

बेकर के खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम आठ पॉलीपेप्टाइड्स को एन्कोड करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य उन सभी को लेबल करना और बाद में उन्हें अलग बैंड के रूप में कल्पना करना है।

बेकर के खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

माइटोकॉन्ड्रिया एरोबिक श्वसन के लिए सक्षम यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक ऑर्गेनेल्स हैं। उनकी शिथिलता मानव रोग का एक प्रसिद्ध स्रोत है। बेकर के खमीर माइटोकॉन्ड्रिया में आठ प्रोटीन को एंकोडिंग करने वाला गोलाकार जीनोम होता है।इस वीडियो में, हमने अनुवाद उत्पादों के रेडियोधर्मी लेबलिंग और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा बाद में अलगाव के माध्यम से खमीर माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन बायोसिंथेसिस को परखने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन किया। प्रक्रिया में कई प्रमुख कदम शामिल हैं। उचित माध्यम के साथ ताजा प्लेटों पर जमे हुए स्टॉक संस्कृतियों से लकीर खमीर।24 से 48 घंटे के लिए 30 डिग्री पर कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ताजा लकीर से माध्यम के दो मिलीलीटर में इन संस्कृतियों टीका और उंहें रात भर 30 डिग्री पर २०० आरपीएम पर आंदोलन इनक्यूबेट । 600 नैनोमीटर की तरंगदैर्ध्य पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें।कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 9, 000 ग्राम पर बाँझ ट्यूब पैलेट खमीर कोशिकाओं में 0.2 अवशोषक इकाइयों के अनुरूप मात्रा ले लो। इस सुपरनेट को त्यागें। कोशिकाओं को पांच सेकंड के लिए भंवर से बाँझ पानी के 0.5 मिलीलीटर के साथ धोएं।कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 9, 000 ग्राम पर पैलेट खमीर कोशिकाओं। सुपरनेट को त्याग दें। ताजा पोंछ आगार माध्यम के दो मिलीलीटर में तनु कोशिकाओं।200 आरपीएम और 30 डिग्री पर लिया गया इनक्यूबेट एज जब तक ऑप्टिकल घनत्व 1.5 से 1.9 मूल्यों तक नहीं पहुंचता है। माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में एक ऑप्टिकल यूनिट के बराबर कल्चर वॉल्यूम ट्रांसफर करें। एक मिनट के लिए 3000 जी पर ट्यूबों स्पिन।सुपरनेट को त्याग दें। कोशिकाओं को पांच सेकंड के लिए भंवर से बाँझ पानी के 0.5 मिलीलीटर के साथ धोएं। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 9, 000 ग्राम पर पैलेट खमीर कोशिकाओं सुपरनैंट त्यागें।बाँझ अनुवाद बफर के 0.5 मिलीलीटर में खमीर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। साइटोसोलिक अनुवाद को बाधित करने के लिए 200 आरपीएम और 30 डिग्री पर लिए गए पांच मिनट के किनारे के लिए 0.2 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर इनक्यूबेट की अंतिम एकाग्रता तक सेलस्पेंसाइड में साइक्लोहेक्सिमाइड जोड़ें।25 से 30 जोड़ें S35 मेथियोनीन के S35 मेथियोनी के 25 से 30 माइक्रोक्यूरी से सेल सस्पेंशन और 200 आरपीएम और 30 डिग्री पर लिए गए 30 मिनट के किनारे के लिए इनक्यूबेट करें। 200 आरपीएम और 30 डिग्री पर लिए गए 10 मिनट के किनारे के लिए लेबलिंग इनक्यूबेट को रोकने के लिए अवेलेबल कोल्ड मेथियोनिन और बोरिमाइसिन जोड़ें। 30 सेकंड के लिए 9, 000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा खमीर कोशिकाओं को ले लीजिए।कोशिकाओं को पांच सेकंड के लिए भंवर से बाँझ पानी के 0.5 मिलीलीटर के साथ धोएं। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 9, 000 ग्राम पर पैलेट खमीर कोशिकाओं। सुपरनेट को त्याग दें।पैलेट और भंवर में पांच से 10 सेकंड के लिए लाइसिस बफर के 75 माइक्रोलीटर जोड़ें। पीएच 6.8 के साथ 0.5 मोलर ट्राइस बफर के 0.5 मोलर ट्राइस बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। पीएच 6.8 के साथ।भंवर संक्षेप में। नमूने में मेथनॉल के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच सेकंड के लिए भंवर।नमूने में क्लोरोफॉर्म के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच सेकंड के लिए भंवर। 12, 000 जी सावधानी से एक पारखी के साथ ओपफेस त्यागने पर दो मिनट के लिए नमूनों अपकेंद्रित्र ।नमूने में मेथनॉल के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें। कई बार ट्यूब को उलटा करके सावधानी से मिलाएं। 12, 000 जी डिस्कार्ड सुपरनेट में दो मिनट के लिए सेंट्रलाइज नमूने।हवा 80 डिग्री पर दो मिनट के लिए पैलेट सूखी। लैमली नमूना बफर के 60 माइक्रोलीटर में उपजी प्रोटीन को भंग करें। नमूनों को 14 डिग्री पर 10 मिनट तक गर्म करें।17.5% लैमली एसडीएस पॉलीएक्रीलामाइड जेल का कारण बनता है। जेब में प्रत्येक नमूने के 15 माइक्रोलीटर लोड करें। जब तक ब्लू डाई जेल लिम्फ के लगभग 65% तक नहीं पहुंच जाता तब तक ठंडे कमरे में जेल चलाएं।कुमासी शानदार नीले रंग के साथ जेल दाग और स्कैन या फोटो जो लोडिंग नियंत्रण के रूप में आवश्यक है बनाते हैं। जेल ड्रायर में जेल सूखी। इसे तीन से पांच दिन तक स्टोरेज फॉस्फोर स्क्रीन के साथ कैसेट में रखें।फॉस्फोर इमेजर पर स्क्रीन को स्कैन करें। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, हमने दो सैकरोमाइसेस सेरेविसिया उपभेदों से माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों को सौंपा। जंगली प्रकार और Aim23 जीन एन्कोडिंग माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद दीक्षा कारक तीन के उत्परिवर्ती संस्करण हटाने।माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों को पहले से ही सक्रिय रूप से लेबल किया गया था और डेनटुरिंग पॉलीएक्रिलैमाइड जेल में अलग किया गया था। समय पाठ्यक्रम बनाने के लिए संतृप्ति से पहले हर ढाई मिनट में नमूने एकत्र किए गए थे । जेल दाग, सूख गया था और पांच दिन प्रदर्शनी के बाद जांच की ।एक सफल प्रयोग के मामले में, चित्र मानक पैटर्न के अनुसार सौंपे गए आठ बैंड को दर्शाता है। हालांकि, तनाव और प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर व्यक्तिगत बैंड की तीव्रता अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती है। प्रत्येक बैंड एक अनुवाद उत्पाद से मेल खाती है।आंकड़ों से पता चलता है कि उत्परिवर्ती तनाव माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषण में सक्षम है क्योंकि जंगली प्रकार में दिखाई देने वाले सभी उत्पाद इस उत्परिवर्ती में दिखाई देते हैं। हालांकि, बैंड की तीव्रता जंगली प्रकार से अलग है, जिसका अर्थ है कि Aim23 के इस विलोपन माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है । कुमासी नीले दाग में पीसा और एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।इमेज जी या इमेज क्वान सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उपभेदों या प्रायोगिक स्थितियों के बीच मतभेदों की पहचान करने के लिए डेटा में उनके परिणाम की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इनके लिए, प्रत्येक उत्पाद के अनुरूप सिग्नल के अनुपात की गणना कुल सिग्नल से की जाती है। मतलब मूल्यों और मानक विचलन की गणना कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों में की जाती है।संश्लेषित प्रोटीन के काइनेटिक्स पर बदल गया एक पिछले साल के प्रयोग में अध्ययन किया है । लेबलिंग प्रतिक्रिया ठंड मेथियोनिन और बोरिमाइसिन द्वारा बंद कर दिया जाता है के बाद संकेत समय बिंदुओं पर नमूने एकत्र किए जाते हैं। उत्पाद की स्थिरता का अनुमान लगाने के लिए यह नियंत्रण आवश्यक है।एंटी-पोरिन एक एंटीबॉडी के साथ इम्यूनो-धुंधला एक लोडिंग नियंत्रण है। हमने विधि का वर्णन किया, जिसका उपयोग अक्सर खमीर माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन बायोसिंथेसिस का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और तेज है।साथ ही, यह चार खमीर माइटोकॉन्ड्रियल mRNAs की अनुवाद दर के बारे में मूल्यवान जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो अत्यधिक लाभप्रद है। हालांकि, इसमें अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता वाली कई सीमाएं हैं और प्रोटीन और RNAs के इस अंतरराज्यीय स्तर में निहित है। यह माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद प्रणाली में इन कार्यों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है, लेकिन तंत्र की खोज के लिए अधिक उन्नत तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Ribosome profiling द्वारा नवोदित खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में Submitochondrial प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

चुनौतीपूर्ण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण के लिए एक समय-कुशल उपकरण के रूप में बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन परख

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण की उच्च-थ्रूपुट छवि-आधारित परिमाणीकरण

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइटों को अलग करने के लिए एक बेहतर तरीका

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...