Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione russa per la ricerca di base, numero di sovvenzione 18-29-07002. P.K. è stato supportato dall'assegnazione statale del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, numero di sovvenzione AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. è stato supportato dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, sovvenzione numero 075-15-2019-1659 (Programma del Kurchatov Center of Genome Research). Il lavoro è stato in parte svolto sulle attrezzature acquistate nell'ambito del Programma di Sviluppo dell'Università Statale di Mosca. I.C., S.L., e M.V.B. sono stati inoltre supportati dalla borsa di studio dell'Università Statale di Mosca "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Preparazione della coltura del lievito
<ol><li>Striature di lievito dalle colture di stock congelate su piatti freschi con il mezzo appropriato. Mettere le piastre in un incubatore di coltura a 30 °C per 24-48 ore. NOTA: Lascia che i mutanti sensibili alla temperatura crescano alla temperatura permissiva.</li>
	<li>Inoculare le colture di lievito in 2 ml di mezzo YPGal (2% peptone, 1% estratto di lievito, 2% di galattosio) dalla striscia fresca in tubi da 15 ml e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/mi...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

Le indagini sull'espressione genica occupano una parte centrale nelle moderne scienze della vita. Sono stati sviluppati numerosi metodi che forniscono informazioni su questo complesso processo. Qui, abbiamo descritto il metodo che consente di accedere alla biosintesi proteica nel lievito di fornaio S. cerevisiae mitochondria. Di solito viene applicato per confrontare le efficienze di traduzione degli mRNA nei mitocondri del ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico per accedere alle conseguenze della m...

I mitocondri sono gli organelli profondamente coinvolti nel metabolismo di una cellula eucariotica. La loro catena di trasferimento di elettroni fornisce alla cellula ATP, la principale valuta energetica utilizzata in più vie biochimiche. Inoltre, sono coinvolti in apoptosi, sintesi di acidi grassi ed eme e altri processi. La disfunzione dei mitocondri è una fonte ben nota di malattia umana1. Può derivare da mutazioni nei geni nucleari o mitocondriali che codificano componenti strutturali o regolatori degli organelli2. Il lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae è un eccellente organismo modello per lo studio dell'espressione genica mitocondriale per diversi motivi. In primo luogo, il loro genomaè completamente sequenziato 3, ben annotato, e una grande somma di dati è già disponibile in letteratura grazie alla lunga storia di indagini condotte con questo organismo. In secondo luogo, le manipolazioni con il loro genoma nucleare sono relativamente veloci e facili a causa del loro rapido tasso di crescita e del sistema di ricombinazione omologo altamente efficiente. In terzo luogo, il lievito di fornaio S. cerevisiae è uno dei pochi organismi per i quali vengono sviluppate le manipolazioni con genomi mitocondriali. Infine, il lievito di fornaio è un organismo facultativo aerobe-anaerobe, che consente l'isolamento e lo studio di mutanti respiratori difettosi, poiché possono crescere in mezzi contenenti fonti di carbonio fermentabili.
Descriviamo il metodo per studiare l'espressione genica mitocondriale del lievito di fornaio S. cerevisiae al livello trascizionale4. Il suo principio principale deriva da diverse osservazioni. In primo luogo, il genoma mitocondriale del lievito codifica solo otto proteine: tre subunità del citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p5. Questo numero è piccolo e tutti possono essere separati per elettroforesi su un singolo gel nelle condizioni appropriate. In secondo luogo, i ribosomi mitocondriali appartengono alla classe procariotica piuttosto che eucariotica 6 e,quindi,la sensibilità agli antibiotici è diversa per i ribosomi citoplasmatici e mitocondriali del lievito. Permette l'inibizione della traduzione citoplasmatica con cicloeximide, fornendo le condizioni quando l'amminoacido etichettato(35S-metonina) è incorporato solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Di conseguenza, l'esperimento fornisce informazioni sul tasso di incorporazione di amminoacidi nelle proteine mitocondriali sintetizzata de novo, riflettendo l'efficienza complessiva della traduzione mitocondriale per ciascuno degli otto prodotti

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirazione aerobica. Contengono un genoma circolare e un apparato di espressione genica. Un genoma mitocondriale del lievito del fornaio codifica per otto proteine: tre subunità della citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di etichettare specificamente queste proteine con metinina 35S, separarle per elettroforesi e visualizzare i segnali come bande discrete sullo schermo. La procedura prevede diversi passaggi. In primo luogo, le cellule di lievito vengono coltivate in un mezzo contenente galattosio fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica tardiva. Successivamente, il trattamento cicloeximide blocca la traduzione citoplasmatica e consente l'incorporazionedi metoionina 35 S solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Quindi, tutte le proteine vengono estratte dalle cellule di lievito e separate dall'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Infine, il gel viene asciugato e incubato con lo schermo di fosforo di stoccaggio. Lo schermo viene scansionato su un fosforimager che rivela le bande. Il metodo può essere applicato per confrontare il tasso di biosintesi di un singolo polipeptide nei mitocondri di un ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico, che è utile per studiare i difetti dell'espressione genica mitocondriale. Questo protocollo fornisce preziose informazioni sul tasso di traduzione di tutti gli mRNA mitocondriali del lievito. Tuttavia, richiede diversi controlli ed esperimenti aggiuntivi per trarre conclusioni adeguate.

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di S. cerevisiae: il tipo selvatico (WT) e una cancellazione mutante del gene AIM23 (AIM23Δ), codificando il fattore di iniziazione alla traduzione mitocondriale 3 (Tabella 1)8. I prodotti di traduzione mitocondriale sono stati etichettati e separati radioattivamente in SDS-PAAG9. I campioni sono stati raccolti ogni 2,5 minuti prima della...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirare aerobicamente. La loro disfunzione è una fonte ben nota di malattie umane. I mitocondri di lievito di Baker contengono genoma circolare che codifica per otto proteine.In questo video, abbiamo descritto il protocollo utilizzato per saggiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito attraverso l'etichettatura radioattiva di prodotti traslazionali e la successiva separazione per elettroforesi gel. La procedura prevede diversi passaggi principali. Striato lievito da colture di stock congelati su piatti freschi con mezzo appropriato.Mettere le piastre nell'incubatore di coltura a 30 gradi per 24-48 ore. Inoculare queste colture in due millilitri di mezzo dalla striscia fresca in un tubo da 15 millilitri e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 gradi. Misurare la densità ottica della coltura alla lunghezza d'onda di 600 nanometri.Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbenza in tubi sterili Palette cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare questo supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi.Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante. Diluire le cellule in due millilitri di mezzo agar fresco.Incubare il bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi fino a quando la densità ottica raggiunge da 1,5 a 1,9 da 1,5 a 1,9 valori. Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di micro centrifuga. Ruotare i tubi a 3000 G per un minuto.Scartare il supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettare le cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente Scartare il supernatante.Sospendere di nuovo le cellule di lievito in 0,5 millilitri di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino alla concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro Incubare per cinque minuti bordo assunto a 200 RPM e 30 gradi per inibire la traduzione citosolica.Aggiungere da 25 a 30 Aggiungere da 25 a 30 microcurie di metinina S35 di metinina S35 alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi. Aggiungere meionina fredda senza etichetta e borimicina per interrompere l'etichettatura Incubate per 10 minuti di bordo prelevato a 200 giri/min e 30 gradi. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 G per 30 secondi.Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante.Aggiungere 75 microlitri di tampone di lysis alla tavolozza e al vortice per cinque o 10 secondi. Aggiungere 500 microlitri di 0,5 tris tampone molare di 0,5 tris buffer molare con pH 6.8. Con pH 6.8.Vortice brevemente. Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Vortice per cinque secondi.Aggiungere 150 microlitri di cloroformio al campione. Vortice per cinque secondi. Centrifugare i campioni per due minuti a 12.000 G.Scartare accuratamente l'opaface con un campionatore.Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte. Centrifuga i campioni per due minuti a 12.000 G.Discard supernatant.Asciugare all'aria la pallette per due minuti a 80 gradi. Sciogliere le proteine precipitate in 60 microlitri di tampone campione Laemmli. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 14 gradi.Causare il gel di poliacrilammide Laemmli SDS al 17,5%. Caricare 15 microlitri di ogni campione nelle tasche. Eseguire il gel nella cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della linfa gel.Macchia il gel con Kumasi blu brillante e fai la scansione o la foto che è richiesta come controllo del carico. Asciugare il gel nell'essiccatore a gel. Tienilo nella cassetta con schermo di fosforo di archiviazione per tre o cinque giorni.Scansiona lo schermo su un imager al fosforo. Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di Saccharomyces cerevisiae. Il tipo selvatico e la variante mutante soppressioni del gene Aim23 che codifica per l'iniziazione alla traduzione mitocondriale fattore tre.I prodotti di traduzione mitocondriale erano già attivamente etichettati e separati nel gel di poliacrilammide denaturante. I campioni venivano raccolti ogni due minuti e mezzo prima della saturazione per costruire il corso di tempo. Il gel è stato macchiato, asciugato e schermato dopo l'esposizione di cinque giorni.Nel caso di un esperimento riuscito, l'immagine mostra otto bande assegnate secondo il modello standard. Tuttavia, le intensità delle singole bande possono essere altamente variabili a seconda della deformazione e delle condizioni sperimentali. Ogni banda corrisponde a un prodotto di traduzione.I dati suggeriscono che il ceppo mutante è in grado di sintesi proteica mitocondriale perché tutti i prodotti che appaiono nel tipo selvaggio sono visibili in questo mutante. Tuttavia, le intensità delle bande sono diverse dal tipo selvaggio, il che significa che questa cancellazione di Aim23 influenza l'espressione genica mitocondriale. Kumasi è stato preparato in macchia blu e funge da controllo del carico.Il loro risultato nei dati può essere quantificato per identificare le differenze tra ceppi o condizioni sperimentali utilizzando il software Image G o Image Quan. Per questi, il rapporto del segnale corrispondente a ogni prodotto viene calcolato al segnale totale. I valori medi e le deviazioni standard sono calcolati in almeno tre esperimenti indipendenti.La cinetica della proteina sintetizzata girata è studiata in un esperimento dell'anno scorso. I campioni vengono raccolti nei punti di tempo indicati dopo che la reazione di etichettatura è stata interrotta dalla meionina fredda e dalla borimicina. Questo controllo è necessario per stimare la stabilità del prodotto.La colorazione immuno-con anti-porina un anticorpo è un controllo del carico. Abbiamo descritto il metodo, che viene spesso utilizzato per studiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito. Questo protocollo è relativamente semplice e veloce da eseguire.Allo stesso tempo, consente di ottenere informazioni preziose sul tasso di traduzione di quattro mRNA mitocondriali di lievito, il che è altamente vantaggioso. Tuttavia, ha diverse limitazioni che richiedono ulteriori esperimenti e si trova in questi livelli interstatali di proteine e mRNA. Può fornire le informazioni su queste funzioni nel sistema di traduzione mitocondriale, ma dovrebbero essere utilizzate tecniche più avanzate per scoprire il meccanismo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Ricerca

Biochimica

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...