Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

이 연구는 기본 연구를위한 러시아 재단에 의해 투자되었다, 부여 번호 18-29-07002. P.K.는 러시아 연방 과학기술고등교육부의 국가 배정에 의해 지원되었으며, AAAA-A16-11602160073-5를 지원받았다. M.V.P.는 러시아 연방 과학 고등 교육부의 지원을 받았으며, 교부번호 075-15-2019-1659(게놈 연구 의 쿠르차토프 센터 프로그램)를 지원받았습니다. 이 작업은 부분적으로 모스크바 주립 대학 개발 프로그램의 프레임에서 구입 한 장비에 수행되었다. I.C., S.L., M.V..B.는 모스크바 주립 대학 교부금 "노아의 방주를 선도하는"에 의해 추가로 지원되었다.

1. 효모 문화 준비
<ol><li>냉동 재고 배양에서 적절한 매체로 신선한 접시에 효모를 줄입니다. 24-48h에 대한 30 °C에서 배양 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 참고: 온도에 민감한 돌연변이가 허용 온도에서 자랄 수 있도록 합니다.</li>
	<li>YPGal 배지 2mL(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 갈모 추출물 2%)에서 효모 배양을 접종하여 15mL 튜브의 신선한 줄무늬에서 30°C에서 200rpm에서 밤새 교반하는 배양합니?...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

유전자 발현의 조사는 현대 생명 과학에 있는 중앙 부분을 차지합니다. 이 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 제공하는 수많은 방법이 개발되었습니다. 여기서, 우리는 베이커의 효모 S. cerevisiae 미토콘드리아에서 단백질 생합성에 접근하는 것을 허용하는 방법을 설명했습니다. 그것은 일반적으로 연구된 돌연변이의 결과에 접근하기 위하여 돌연변이 효모 긴장대 미토콘드리아에 있는 mRNAs?...

미토콘드리아는 진핵 세포의 대사에 깊이 관여하는 세포기관입니다. 그들의 전자 전송 사슬은 여러 생화학 경로에 사용되는 주요 에너지 통화 인 ATP로 세포를 공급합니다. 게다가, 그들은 석 면에 관여, 지방산과 헴 합성, 그리고 다른 프로세스. 미토콘드리아의 기능 장애는 인간 질환 1의 잘 알려진소스이다. 그것은 세포기관2의구조 또는 조절 성분을 코딩하는 핵 또는 미토콘드리아 유전자에 있는 돌연변이에서 유래할 수 있습니다. 베이커의 효모 사카로미세스 세레비시아는 여러 가지 이유로 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 우수한 모델 유기체입니다. 첫째, 그들의 게놈은 완전히 시퀀스3,잘 음부, 데이터의 큰 합계는 이 유기체로 실행된 조사의 긴 역사 덕분에 문학에서 이미 유효합니다. 둘째, 핵 게놈을 가진 조작은 그들의 빠른 성장 속도와 고도로 효율적인 상동성 재조합 시스템 때문에 상대적으로 빠르고 쉽습니다. 셋째, 제빵사의 효모 S. cerevisiae는 미토콘드리아 게놈으로 조작이 개발되는 몇 안되는 유기체 중 하나입니다. 마지막으로, 제빵사의 효모는 발효 탄소 공급원을 함유하는 미디어에서 성장할 수 있기 때문에 호흡기 결함이 있는 돌연변이를 격리하고 연구할 수 있는 에어로브-혐기성 자극 유기체입니다.
우리는 번역 수준4에서제빵사 효모 S. cerevisiae의 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 방법을 설명합니다. 그것의 주요 원칙은 여러 관찰에서 온다. 첫째, 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 단백질만 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p5의서브유닛. 이 숫자는 작고, 그들 모두는 적절한 조건에서 단일 젤에 전기 전광에 의해 분리 될 수있다. 둘째, 미토콘드리아 리보솜은 진핵6이아닌 원핵계 클래스에 속하며, 따라서 항생제에 대한 민감성은 효모 세포질 및 미토콘드리아 리보좀에 대해 다릅니다. 그것은 세포혈증 번역의 억제를 허용, 라벨 아미노산(35S-메티오닌)가 미토콘드리아 번역 제품에만 통합 될 때 조건을 제공. 그 결과, 이 실험은 미토콘드리아 단백질합성 드 노보에 아미노산 의 혼입 속도에 대한 정보를 제공하여 8개 제품에 대한 미토콘드리아 번역의 전반적인 효율을 반영합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

미토콘드리아는 호기성 호흡이 가능한 진핵세포의 필수 세포입니다. 그(것)들은 원형 게놈 및 유전자 발현 장치를 포함합니다. 제빵사의 효모의 미토콘드리아 게놈은 8가지 단백질을 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p의 서브유닛. 여기서 설명된 방법의 목적은 이러한 단백질을 35S메티오닌으로 구체적으로 라벨링하고, 전기포고에 의해 분리하고 신호를 화면에 이산밴드로 시각화하는 것이다. 절차는 몇 가지 단계를 포함한다. 첫째, 효모 세포는 후기 로와산성장 단계에 도달할 때까지 갈라토스 함유 배지에서 배양된다. 다음으로, 사이클로헤시미드 치료는 세포질 번역을 차단하고 미토콘드리아 번역 제품에만 35S 메티오닌을 통합할 수 있습니다. 그런 다음, 모든 단백질은 효모 세포에서 추출되고 폴리 아크릴라미드 젤 전기 포광에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 젤은 저장 인광판으로 건조되고 배양됩니다. 화면은 밴드를 드러내는 인산화기에서 스캔됩니다. 이 방법은 미토콘드리아 유전자 발현 결함을 연구하는 데 유용한 야생형대 돌연변이 효모 균주의 미토콘드리아내 단일 폴리펩타이드의 생합성 율을 비교하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 그러나 적절한 결론을 내리기 위해서는 여러 가지 제어 및 추가 실험이 필요합니다.

전술한 프로토콜에 따라, 우리는 두 가지 S. 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당: 야생 형(WT)및 AIM23 유전자의 돌연변이 베어링 삭제(AIM23Δ),인코딩 미토콘드리아 번역 개시 인자 3(표 1)8. 미토콘드리아 번역 제품은 SDS-PAAG9에서 방사성 라벨을 부착하고 분리시켰다. 샘플은 포화 전에 2.5 분마다 수집하여 시간 과정<strong class="xfig...

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Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

미토콘드리아는 호기성 호흡을 할 수 있는 진핵세포의 필수 세포입니다. 그들의 기능 장애는 인간 질병의 잘 알려진 소스. 베이커의 효모 미토콘드리아는 8개의 단백질을 인코딩하는 원형 게놈을 포함합니다.본 비디오에서는, 우리는 번역 제품의 방사성 라벨링 및 겔 전기포고에 의한 후속 분리를 통해 효모 미토콘드리아에서 단백질 생합성을 분석하는 데 사용되는 프로토콜을 설명했습니다. 절차에는 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다. 적절한 매체와 신선한 접시에 냉동 재고 문화에서 효모를 줄입니다.24~48시간 동안 배양인을 30도에서 30도로 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에서 신선한 줄무늬에서 매체의 두 밀리리터에 이러한 문화를 접종하고 30도에서 200 RPM에서 하룻밤 교반을 배양. 600 나노미터의 파장에서 배양의 광학 밀도를 측정합니다.실온에서 30초 동안 9, 000G에서 멸균 튜브 팔레트 효모 셀에서 0.2 흡수장치에 해당하는 부피를 복용하십시오. 이 상체를 폐기하십시오. 5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면.실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포. 상부체를 폐기합니다. 신선한 닦아 한천 매체의 두 밀리리터에 세포를 희석.광학 밀도가 1.5에서 1.9값으로 1.5에서 1.9로 도달할 때까지 200 RPM 및 30도에서 가져온 인큐베이션 엣지. 마이크로 원심분리기 튜브의 하나의 광학 장치에 해당하는 배양 량을 전송합니다. 튜브를 3000 G에서 1분 동안 회전시합니다.상부체를 폐기합니다. 5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면. 실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포는 상피셀을 폐기합니다.멸균 번역 버퍼의 0.5 밀리리터에서 효모 세포를 다시 중단합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브에 놓습니다. 세포 현탁액에 사이클로헨시미드를 200 RPM 및 30도에서 5분 동안 밀리리터 인큐베이터당 0.2 밀리그램의 최종 농도까지 세포 현탁액에 추가하여 세포 변환을 억제합니다.S35 메티오닌의 S35 메티오닌의 25 ~30 마이크로큐리에서 25 ~ 30 마이크로큐리를 세포 현탁액에 넣고 200 RPM 및 30도에서 30분 동안 에큐베이트합니다. 라벨이 부착되지 않은 차가운 메티오닌과 보리미신을 추가하여 200 RPM과 30도에서 10분 동안 라벨이 붙는 인큐베이터를 중지합니다. 30초 동안 9, 000G에서 원심분리로 효모 세포를 수집합니다.5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면. 실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포. 상부체를 폐기합니다.팔레트와 소용돌이에 75 마이크로리터의 용액 을 5~10초 간 추가합니다. pH 6.8로 0.5 어어 트리버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. pH 6.8.소용돌이가 짧게. 샘플에 메탄올 600 마이크로리터를 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이.샘플에 150 마이크로리터의 클로로폼을 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이. 12, 000 G.에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리하여 샘플러로 오파페이스를 조심스럽게 폐기하십시오.샘플에 메탄올 600 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전시켜 조심스럽게 섞는다. 원심분리기 샘플은 12, 000 G.에서 2분 동안 시료를 폐기합니다.80도에서 2분간 파렛을 공기가 건조시다. Laemmli 샘플 버퍼의 60 마이크로 리터에 침전 된 단백질을 녹입니다. 샘플을 14도에서 10분간 가열합니다.17.5%의 Laemmli SDS 폴리아크라이글라미드 젤을 생성합니다. 주머니에 각 샘플의 15 마이크로 리터를로드합니다. 파란 염료가 젤 림프의 약 65 %에 도달 할 때까지 차가운 방에서 젤을 실행합니다.구마티 스티글 블루로 젤을 염색하고 로딩 컨트롤에 필요한 스캔이나 사진을 만듭니다. 젤 건조기에서 젤을 건조시십시오. 3~5일 동안 보관 형인 스크린으로 카세트에 보관하십시오.인광 선상에서 화면을 스캔합니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 우리는 두 개의 사카로미세스 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당했습니다. 미토콘드리아 번역 개시 인자 3을 인코딩하는 Aim23 유전자의 야생 유형 및 돌연변이 변이체 삭제.미토콘드리아 번역 제품은 이미 폴리아크릴아미드 겔에서 적극적으로 표지되고 분리되었다. 샘플은 채도 가 되기 전에 2분 반마다 수집되어 시간 과정을 구축했습니다. 젤은 5일 박람회 후 염색, 건조 및 스크리닝되었다.성공적인 실험의 경우, 그림은 표준 패턴에 따라 할당 된 8 개의 밴드를 보여줍니다. 그러나, 개별 밴드의 강도는 변형 및 실험 조건에 따라 매우 가변적일 수 있다. 각 밴드는 하나의 번역 제품에 해당합니다.데이터는 야생 모형에 나타나는 모든 제품이 이 돌연변이에서 보이기 때문에 돌연변이 균주가 미토콘드리아 단백질 합성이 가능하다는 것을 건의합니다. 그러나, 밴드의 강도는 야생 유형과 다르며, 이는 Aim23의 이러한 삭제가 미토콘드리아 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 쿠마시 블루 얼룩으로 양조하였고 로딩 컨트롤역할을 합니다.이미지 G 또는 Image Quan 소프트웨어를 사용하여 균주 또는 실험 조건 간의 차이점을 식별하기 위해 데이터를 정량화할 수 있습니다. 이를 위해, 모든 제품에 대응하는 신호의 비율은 총 신호로 계산된다. 평균 값 및 표준 편차는 적어도 세 번의 독립적인 실험에서 계산됩니다.인계된 합성 단백질의 운동학은 지난 해의 실험에서 연구됩니다. 샘플은 차가운 메티오닌과 보리마이신에 의해 라벨링 반응이 중단된 후 표시된 시점에서 수집됩니다. 이 제어는 제품의 안정성을 추정하기 위해 필요합니다.항 포린 을 가진 면역 염색은 1개의 항체를 가진 로딩 통제입니다. 우리는 효모 미토콘드리아에서 단백질 생합성을 연구하는 데 자주 사용되는 방법을 설명했습니다. 이 프로토콜은 비교적 간단하고 빠르게 수행할 수 있습니다.동시에, 매우 유리한 4 개의 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나, 그것은 추가 실험을 필요로 하는 몇 가지 제한이 있으며 단백질과 mRNA의이 주간 수준에 거짓말. 미토콘드리아 번역 시스템에서 이러한 기능에 대한 정보를 제공할 수 있지만 메커니즘을 발견하기 위해 보다 진보된 기술을 사용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

연구

생화학

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...