Name: labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Denna forskning finansierades av ryska stiftelsen för grundforskning, anslag nummer 18-29-07002. P.K. stöttades av Statligt uppdrag av departement av vetenskap och högre utbildning av Ryska federationen, anslag numrerar AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. stöddes av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning, bidragsnummer 075-15-2019-1659 (Program of Kurchatov Center of Genome Research). Arbetet gjordes delvis på den utrustning som köptes inom ramen för Moskvas statliga universitetsprogram för utveckling. I.C., S.L., och M.V.B. stöttades dessutom av Moscow state university anslag "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Förberedelse av jästkultur
<ol><li>Strimma jäst från de frysta lagerkulturerna på färska tallrikar med lämpligt medium. Sätt plattorna i en kulturinkubator vid 30 °C i 24–48 timmar. OBS: Låt de temperaturkänsliga mutanterna växa vid den tillåtna temperaturen.</li>
	<li>Inokulera jästkulturer i 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% jästextrakt, 2% galaktos) från den färska strecket i 15 ml-rör och inkubera dem över natten som agiterar vid 200 varv/min vid 30 °C.</li>
	<li>Mät kulturens optiska de...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

Undersökningar av genuttryck upptar en central del i moderna livsvetenskaper. Många metoder som ger insikter om denna komplexa process har utvecklats. Här beskrev vi metoden som gör det möjligt att få tillgång till proteinbiosyntes i bagerijäst S. cerevisiae mitokondrier. Det tillämpas vanligtvis för att jämföra översättningseffektiviteten hos mRNAs i mitokondrier av mutant jäst stam kontra vild typ för att få tillgång till konsekvenserna av den studerade mutationen. Detta är ett av de grundl?...

Mitokondrier är de organeller som är djupt involverade i metabolismen av en eukaryota cell. Deras elektronöverföringskedja förser cellen med ATP, den viktigaste energiska valutan som används i flera biokemiska vägar. Dessutom är de involverade i apoptos, fettsyra och hemsyntes och andra processer. Dysfunktion av mitokondrier är en välkänd källa till mänsklig sjukdom1. Det kan bero på mutationer i nukleära eller mitokondriella gener som kodar strukturella eller regulatoriska komponenter i organellerna2. Bakers jäst Saccharomyces cerevisiae är en utmärkt modellorganism för att studera mitokondriell genuttryck på grund av flera skäl. För det första är deras arvsmassa heltsekvenserad 3, väl kommenterad, och en stor mängd data finns redan i litteraturen tack vare den långa historien av undersökningar som utförs med denna organism. För det andra är manipuleringarna med sitt kärngenom relativt snabba och enkla på grund av deras snabba tillväxttakt och mycket effektiva homologa rekombinationssystem. För det tredje är bagerijäst S. cerevisiae en av de få organismer för vilka manipuleringarna med mitokondriella genom utvecklas. Slutligen är bagerijäst en aerobe-anaerobe facultative organism, som tillåter isolering och studier av luftvägarna defekta mutanter, eftersom de kan växa i medier som innehåller fermenterbara kolkällor.
Vi beskriver metoden att studera mitokondriell gen uttryck av bageri jäst S. cerevisiae på translationell nivå4. Dess huvudprincip kommer från flera observationer. För det första kodar jäst mitokondriellt genom endast åtta proteiner: tre underenheter av cytokrom c oxidas (Cox1p, Cox2p och Cox3p), tre underenheter av ATP-syntasen (Atp6p, Atp8p och Atp9p), en underavdelning till ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktasenzymet, cytokrom b (Cytb) och mitokondriellt ribosomprotein Var1p5. Detta antal är litet, och alla kan separeras med elektrofores på en enda gel under lämpliga förhållanden. För det andra tillhör mitokondriella ribosomer den prokaryota klassen snarare än eukaryota6, och därför är känsligheten för antibiotika annorlunda för jästcytoplasmiska och mitokondriella ribosomer. Det möjliggör hämning av cytoplasmisk översättning med cykloheximid, vilket ger villkoren när den märktaaminosyran (35S-metionin) endast ingår i mitokondriella översättningsprodukter. Som ett resultat ger experimentet information om frekvensen av aminosyrainkorporering i mitokondriella proteiner syntetiserade de novo, vilket återspeglar den totala effektiviteten av mitokondriell översättning för var och en av de åtta produkterna

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som kan aeroba andning. De innehåller cirkulärt genom och genuttrycksapparatur. Ett mitokondriellt genom av bagerijäst kodar för åtta proteiner: tre underenheter av cytokrom c oxidas (Cox1p, Cox2p och Cox3p), tre underenheter av ATP-syntasen (Atp6p, Atp8p och Atp9p), en underavdelning till ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktasenzymet, cytokrom b (Cytb) och mitokondriellt ribosomprotein Var1p. Syftet med metoden som beskrivs här är att specifikt märka dessa proteiner med 35S metionin, separera dem med elektrofores och visualisera signalerna som diskreta band på skärmen. Förfarandet omfattar flera steg. Först odlas jästceller i ett galaktosinnehållande medium tills de når det sena logaritmiska tillväxtstadiet. Därefter blockerar cykloheximidbehandling cytoplasmisk översättning och tillåter endast 35S metionininkorporation i mitokondriella översättningsprodukter. Sedan extraheras alla proteiner från jästceller och separeras med polyakrylamidgelelektrofores. Slutligen torkas och inkuberas gelén med lagringsfosforskärmen. Skärmen skannas på en fosforimager som avslöjar banden. Metoden kan tillämpas för att jämföra biosyntesen av en enda polypeptid i mitokondrierna hos en mutantjäststam jämfört med den vilda typen, vilket är användbart för att studera mitokondriella genuttrycksdefekter. Detta protokoll ger värdefull information om översättningshastigheten för alla jäst mitokondriella mRNAs. Det krävs dock flera kontroller och ytterligare experiment för att dra lämpliga slutsatser.

Enligt det protokoll som beskrivs ovan tilldelade vi mitokondriella översättningsprodukter från två S. cerevisiae-stammar: den vilda typen (WT) och en mutantlagerborttagning av AIM23-genen (AIM23Δ), kodning mitokondriell översättningsinitieringsfaktor 3 (tabell 1)8. Mitokondriella översättningsprodukter var radioaktivt märkta och separerade i SDS-PAAG9. Proverna samlades in var 2,5 minut före mättnad för att bygga en tidskurs (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Bakers jäst mitokondriella genom kodar för åtta polypeptider. Målet med det nuvarande protokollet är att märka dem alla och därefter visualisera dem som separata band.

Märkning och visualisering av mitokondriella genomuttrycksprodukter i bagerijäst Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som kan andas aerob andning. Deras dysfunktion är en välkänd källa till mänsklig sjukdom. Bakers jäst mitokondrier innehåller cirkulärt genom som kodar åtta proteiner.I den här videon beskrev vi protokollet som används för att analysera proteinbiosyntes i jäst mitokondrier med hjälp av radioaktiv märkning av translationella produkter och efterföljande separation med gelelektrofores. Förfarandet innehåller flera viktiga steg. Strimma jäst från frysta lagerkulturer på färska tallrikar med lämpligt medium.Sätt plattorna i kulturinkubatorn på 30 grader i 24 till 48 timmar. Inokulera dessa kulturer i två milliliter medium från den färska strecket i ett 15 milliliter rör och inkubera dem över natten agitera vid 200 RPM vid 30 grader. Mät kulturens optiska densitet vid våglängden på 600 nanometer.Ta volymen motsvarande 0,2 absorbansenheter i sterila rör Palettjästceller vid 9 000 G i 30 sekunder vid rumstemperatur. Kassera denna supernatant. Tvätta cellerna med 0,5 milliliter sterilt vatten genom att virvla i fem sekunder.Pallette jästceller vid 9 000 G i 30 sekunder vid rumstemperatur. Kassera supernaten. Späd celler i två milliliter färskt torka agar medium.Inkubera kanten vid 200 varv/min och 30 grader tills den optiska densiteten når från 1,5 till 1,9 från 1,5 till 1,9 värden. Överför odlingsvolymen motsvarande en optisk enhet i mikrocentrifugröret. Snurra rören till 3000 G i en minut.Kassera supernaten. Tvätta cellerna med 0,5 milliliter sterilt vatten genom att virvla i fem sekunder. Pallette jästceller vid 9 000 G i 30 sekunder vid rumstemperatur Kassera supernaten.Suspendera jästcellerna igen i 0,5 milliliter steril översättningsbuffert. Placera fjädringen i 15 milliliter rör. Tillsätt cykloheximid till cellupphängning upp till slutlig koncentration på 0,2 milligram per milliliter Inkubat i fem minuter kant tagen vid 200 RPM och 30 grader för att hämma cytosolisk översättning.Tillsätt från 25 till 30 Tillsätt från 25 till 30 mikrocurie S35-metionin av S35-metionin till cellupphängning och inkubera i 30 minuters kant vid 200 varv/min och 30 grader. Tillsätt omärkt kall metionin och borymycin för att stoppa märkningen Inkubat i 10 minuter kant tagen vid 200 RPM och 30 grader. Samla jästceller genom centrifugering vid 9 000 G i 30 sekunder.Tvätta cellerna med 0,5 milliliter sterilt vatten genom att virvla i fem sekunder. Pallette jästceller vid 9 000 G i 30 sekunder vid rumstemperatur. Kassera supernaten.Tillsätt 75 mikroliter lysbuffert till paletten och virveln i fem till tio sekunder. Tillsätt 500 mikroliter 0,5 molar tris buffert på 0,5 molar tris buffert med pH 6.8. Med pH 6,8.Vortex kort. Tillsätt 600 mikroliter metanol till provet. Vortex i fem sekunder.Tillsätt 150 mikroliter kloroform till provet. Vortex i fem sekunder. Centrifugera proverna i två minuter vid 12 000 G.Kassera försiktigt opaface med en provtagare.Tillsätt 600 mikroliter metanol till provet. Blanda försiktigt genom att vända röret flera gånger. Centrifugprover i två minuter vid 12 000 G.Kassera supernatant.Lufttorka pallen i två minuter vid 80 grader. Lös upp fällda proteiner i 60 mikroliter Laemmli provbuffert. Värm proverna i 10 minuter vid 14 grader.Orsaka 17,5%Laemmli SDS polyakrylamidgel. Ladda 15 mikroliter av varje prov i fickorna. Kör gelén i kylrummet tills det blå färgämnet når cirka 65% av gellymfen.Färga gelén med Kumasi lysande blå och gör skanning eller foto som krävs som lastkontroll. Torka gelén i geltorken. Förvara den i kassetten med förvaringsfosforskärm i tre till fem dagar.Skanna skärmen på fosforbildaren. Efter protokollet som beskrivs ovan tilldelade vi mitokondriell översättning produkter från två Saccharomyces cerevisiae stammar. Den vilda typen och mutant variant borttagning av Aim23 gen kodning mitokondriell översättning inledande faktor tre.Mitokondriella översättningsprodukter var redan aktivt märkta och separerade i denaturerande polyakrylamidgelen. Proverna samlades in varannan och en halv minut före mättnad för att bygga tidskursen. Gelén var fläckig, torkad och screenad efter fem dagars utställning.Vid ett lyckat experiment visar bilden åtta band som tilldelats enligt standardmönstret. Intensiteten hos enskilda band kan dock vara mycket varierande beroende på belastning och experimentella tillstånd. Varje band motsvarar en översättningsprodukt.Data tyder på att mutantstammen kan mitokondriell proteinsyntes eftersom alla produkter som förekommer i den vilda typen är synliga i denna mutant. Bandens intensitet skiljer sig dock från den vilda typen, vilket innebär att denna borttagning av Aim23 påverkar mitokondriellt genuttryck. Kumasi bryggs i blå fläck och fungerar som en lastkontroll.Deras resultat i data kan kvantifieras för att identifiera skillnader mellan stammar eller experimentella tillstånd med hjälp av Image G- eller Image Quan-programvara. För dessa beräknas förhållandet mellan signalen som motsvarar varje produkt och den totala signalen. Medelvärden och standardavvikelser beräknas i minst tre oberoende experiment.Kinetiken med syntetiserat protein som vänds studeras i ett tidigare års experiment. Prover samlas in vid de angivna tidpunkterna efter att märkningsreaktionen stoppats av kall metionin och borymycin. Denna kontroll är nödvändig för att uppskatta produktens stabilitet.Immuno-färgning med Anti-Porin en antikroppar är en lastningskontroll. Vi beskrev metoden, som ofta används för att studera proteinbiosyntes i jäst mitokondrier. Detta protokoll är relativt enkelt och snabbt att utföra.Samtidigt gör det det möjligt att få värdefull information om översättningshastigheten för fyra jäst mitokondriella mRNAs, vilket är mycket fördelaktigt. Det har dock flera begränsningar som kräver ytterligare experiment och ligger i dessa mellanstatliga nivåer av proteiner och mRNAs. Det kan ge information om dessa funktioner i mitokondriell översättningssystem, men mer avancerade tekniker bör användas för att upptäcka mekanismen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Användning av Grafix för påvisande av transienta interactorer av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analys av neutral lipidsyntes i Sackaromyces cerevisiae av metabolisk märkning och tunnskiktskromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Bedömning av inochondriell proteinlokalisering i spirande jäst sackaromyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown-analys i kombination med samuttryck i bakterieceller som ett tidseffektivt verktyg för att testa utmanande protein-proteininteraktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbaserad kvantifiering av mitokondriell DNA-syntes och distribution med hög kapacitet

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

En förbättrad metod för att isolera mitokondriella kontaktställen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...