Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido que pode fornecer biomoléculas eficientemente para uma variedade de pesquisas e aplicações terapêuticas baseadas em células. A principal vantagem deste sistema é que ele permite a entrega rápida de biomoléculas às células, mantendo sua viabilidade. É uma tecnologia de plataforma que permite que as células sejam transformadas para uma variedade de aplicações terapêuticas celulares, como o tratamento do câncer.
Comece combinando 54 gramas de base PDMS e seis gramas de agente de cura em um copo. Misture vigorosamente e completamente com uma espátula por pelo menos um minuto, em seguida, colocou o copo com a solução PDMS em um desiccador por aproximadamente 30 minutos ou até que as bolhas de ar remanescentes sejam removidas. Coloque um wafer revestido fotoresistista com os padrões voltados para cima em uma placa de Petri de 150 milímetros, em seguida, despeje a solução PDMS sobre o molde.
Se necessário, coloque a placa de Petri dentro de um desiccador e aplique vácuo até que as bolhas de ar remanescentes desapareçam. Transfira a placa de Petri para um forno de laboratório e asse por duas horas a 60 graus Celsius para curar o PDMS. Após a cura, remova cuidadosamente o PDMS da placa de Petri, cortando as bordas do wafer com uma lâmina de barbear.
Corte cada dispositivo individual usando uma faca ou lâmina de barbear, em seguida, faça furos através das portas de entrada e saída usando um soco de biópsia de 2,5 milímetros. Depois de tratar o dispositivo PDMS com plasma de oxigênio, coloque imediatamente cada dispositivo em um slide de microscópio de vidro de limão de soda limpo com canais voltados para a superfície do vidro. Permita que os dispositivos se unam durante a noite à temperatura ambiente.
Aplique suavemente silicone na superfície do transdutor piezo de um centímetro de diâmetro com uma espessura de um a dois milímetros, em seguida, cuidadosamente alinhado o transdutor com uma espiral concêntrica e pressione-o suavemente na parte inferior do slide do microscópio de vidro. Conecte um microcontrolador a um computador usando um cabo USB A a B. Um led de energia verde deve acender.
Use o software associado no computador para carregar um programa que gera um sinal de oito mega-hertz. Soldar um fio de calibre de 22 polegadas até a extremidade de cada fio no transdutor PZT. Em seguida, use-o para conectar o fio terminal negativo do transdutor PZT a um pino GND.
Conecte o fio terminal positivo do transdutor PZT ao pino de saída através do fio soldado. Corte seções de três a seis polegadas de tubos de plástico macio tygon PVC e empurre a tubulação para dentro das portas de entrada e saída. Pode ser necessário girar a tubulação enquanto aplica pressão até que se encaixe na abertura.
Opcionalmente, a cola pode ser aplicada na junção para unir o PDMS e a tubulação. Opcionalmente, monte o dispositivo acoustofluidic e o microcontrolador em uma caixa impressa 3D. Monte o reservatório microfluido de acordo com as instruções do fabricante.
Corte uma seção de três a seis polegadas de tubos de plástico de plástico macio tygon PVC de 1/16 polegadas de diâmetro interno e empurre-o sobre a tubulação de diâmetro interno de 1/32 polegadas da saída do reservatório microfluido. Opcionalmente, enrole a junção com filme de parafina para evitar vazamentos. Encha uma seringa de 60 mililitros com ar ambiente na lateral do reservatório microfluido.
Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de 200 mililitros por hora para empurrar as soluções do agente de contraste através do dispositivo acoustofluido a uma taxa de fluxo volumoso de 50 mililitros por hora e colete as amostras da saída do dispositivo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Prepare uma solução fofolipílica em um frasco de cintilação de 20 mililitros adicionando 25 miligramas de DSPC, 11,6 miligramas de DSEPC, 0,26 miligramas de DSPG e 0,88 miligramas de estearato de polixietileno40. Adicione clorofórmio até que todos os fosfolipídios sejam dissolvidos.
Evaporar clorofórmio em um desiccator por 48 horas para formar uma filme lipídico seco. Reidratar a espuma com 10 mililitros de PBS estéril e, em seguida, sonicar a solução lipídica por três minutos a 40% de amplitude para formar uma solução micelar cônica. Após a sônicação, a solução fofolipídida pode ser armazenada de dois a seis graus Celsius por até um mês.
Para preparar agentes de contraste de ultrassom, adicione 200 microliters de solução micelar cônica em 600 microliters de PBS estéril a um frasco de septo de vidro de dois mililitros. Sele o frasco acariciando a tampa. Use uma agulha de calibre 1,5 polegadas de 20 polegadas para encher o espaço da cabeça do frasco com gás decafluorobutano por 30 segundos.
Amalgamar o frasco para formar agentes de contraste de ultrassom cheios de gás perfluorobutano. Adicione 25 microliters de solução de agente de contraste de ultrassom por um mililitro de solução celular. Em seguida, bombeie imediatamente o agente de contraste combinado e a mistura celular através do dispositivo acoustofluido.
Este protocolo produz um sistema aoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares. A entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias foi melhorada com tratamento acoustofluido em comparação com um grupo de controle não tratado. A intensidade da fluorescência das células T aumentou cinco vezes após o tratamento, indicando maior entrega de fluoresceína.
A viabilidade celular diminuiu ligeiramente após um tratamento acoustofluido, mas permaneceu acima de 80% O tratamento intracelular aumentou a entrega intracelular de um composto conservante trehalose para células de carcinoma pulmonar A549 humanos em comparação com o fluxo sozinho e para as células do grupo controle não tratado. Adicionar os microbolhas cationic à solução celular é fundamental. A entrega intracelular de biomoléculas será limitada sem microbolhas cationic em solução.
Esta plataforma permite a entrega intracelular de várias biomoléculas, que podem alterar a função celular para pesquisa ou fins terapêuticos. Após a conclusão desse procedimento, pode ser realizada caracterização celular adicional para avaliar o impacto da entrega de diversas biomoléculas.
