Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

ونود أن نشكر الدكتور سام هانلون وإيفلين براون ومارغريت غوندو على مساعدتهم التقنية الممتازة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 EY-018239 و P30 EY007551 (المعهد الوطني للعيون) ، جزئيا من قبل مؤسسة الأسد للبصر ، وجزؤا من قبل NIH 1R15 HD084262-01 (المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية).

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الموصوفة في بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في أبحاث الرؤية وطب العيون وكلية هيوستن للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات البصريات. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل المؤسسات التي تم التعامل ?...

الغرض من ورقة الأساليب هذه هو تسليط الضوء على منهجية إعداد الأنسجة والتصوير التي سمحت لمختبرنا بالتقاط صور المجهر الإلكتروني التسلسلي عالية الدقة بشكل موثوق ، والإشارة إلى الخطوات الحاسمة التي تؤدي إلى هذه النتيجة وكذلك المزالق المحتملة التي يمكن أن تحدث عند إجراء التصوير SBF-SEM. النجاح ب?...

تم وصف المجهر الإلكتروني (SBF-SEM) لأول مرة من قبل Leighton في عام 1981 حيث صمم مجهرا إلكترون المسح الضوئي معززا بفغر صغير مدمج يمكن أن يقطع ويصور أقساما رقيقة من الأنسجة المضمنة في الراتنج. لسوء الحظ، القيود التقنية حصرت استخدامه في العينات التوصيلية، حيث تراكمت عينات غير موصلة مثل الأنسجة البيولوجية مستويات غير مقبولة من الشحن (تراكم الإلكترون داخل عينة الأنسجة)1. في حين طلاء كتلة الوجه بين التخفيضات مع الكربون المتبخر خفض شحن الأنسجة، وهذا الوقت زيادة كبيرة في اقتناء التصوير وتخزين الصور ظلت مشكلة كما تكنولوجيا الكمبيوتر في ذلك الوقت لم تكن كافية لإدارة أحجام الملفات الكبيرة التي أنشأها الجهاز. تمت إعادة النظر في هذه المنهجية من قبل دنك وهورستمان في عام 2004 باستخدام SBF-SEM مجهزة بغرفة ضغطمتغيرة 2. وقد سمح ذلك بإدخال بخار الماء إلى غرفة التصوير مما يقلل من الشحن داخل العينة ، مما يجعل تصوير العينات غير التوصيلية قابلا للتطبيق وإن كان مع فقدان دقة الصورة. مزيد من التحسينات في إعداد الأنسجة وطرق التصوير تسمح الآن للتصوير باستخدام فراغ عالية، والتصوير SBF-SEM لم يعد يعتمد على بخار الماء لتبديل الشحن3،4،5،6،7،8،9. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه.
SBF-SEM يسمح لجمع الآلي من الآلاف من الصور المجهر الإلكتروني المسجلة تسلسليا، مع قرار مستو صغيرة مثل 3-5 نانومتر10،11. يتم وضع الأنسجة، المشربة بالمعادن الثقيلة والمضمنة في الراتنج، داخل المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) التي تحتوي على بروتين فائق مزود بسكين الماس. يتم قطع سطح مستو بسكين الماس ، ويتم سحب السكين ، ويتم مسح سطح الكتلة في نمط النقطية مع شعاع الإلكترون لإنشاء صورة للبنية فوقية الأنسجة. ثم يتم رفع الكتلة كمية محددة (على سبيل المثال، 100 نانومتر) في المحور z، والمعروفة باسم "خطوة z"، ويتم قطع سطح جديد قبل تكرار العملية. وبهذه الطريقة يتم إنتاج كتلة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الصور أثناء قطع الأنسجة. يستفيد نظام التصوير هذا بشكل أكبر من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد.
في حين أن التصوير SBF-SEM يستخدم في المقام الأول الإلكترونات المكثرة لتشكيل صورة لوجه الكتلة ، يتم إنشاء الإلكترونات الثانوية أثناء عملية التصوير12. يمكن أن تتراكم الإلكترونات الثانوية ، إلى جانب الإلكترونات المكبتة والحزمة الأولية التي لا تفلت من الكتلة ، وتنتج "شحن الأنسجة" ، مما يمكن أن يؤدي إلى حقل كهربائي محلي في وجه الكتلة. يمكن أن يشوه تراكم الإلكترون هذا الصورة أو يتسبب في إخراج الإلكترونات من الكتلة والمساهمة في الإشارة التي يجمعها كاشف الرواصد الخلفي ، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء13. في حين يمكن خفض مستوى شحن الأنسجة عن طريق تقليل الجهد شعاع الإلكترون أو كثافة، أو تقليل وقت الإسهاب شعاع، وهذا يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء14. عندما يتم استخدام شعاع إلكترون من الجهد المنخفض أو الكثافة ، أو يسمح للشعاع فقط بالسكن داخل كل مساحة بكسل لفترة أقصر من الزمن ، يتم إخراج الإلكترونات الأقل تشتتا من الأنسجة والتقاطها بواسطة كاشف الإلكترونات مما يؤدي إلى إشارة أضعف. تعامل دنك وهورستمان مع هذه المشكلة من خلال إدخال بخار الماء إلى الغرفة ، وبالتالي تقليل الشحن في الغرفة وعلى وجه الكتلة على حساب دقة الصورة. مع ضغط غرفة من 10-100 السلطة الفلسطينية، وتناثر جزء من شعاع الإلكترون المساهمة في ضوضاء الصورة وفقدان الدقة، ولكن هذا ينتج أيضا أيونات في غرفة العينة التي تحييد تهمة داخل كتلة العينة2. أساليب أكثر حداثة لتحييد تهمة داخل كتلة عينة استخدام حقن الغاز البؤري من النيتروجين على كتلة الوجه أثناء التصوير، أو إدخال الجهد السلبي إلى مرحلة SBF-SEM لتقليل طاقة المسبار شعاع الشحن وزيادةإشارةجمعت 6،7،15. بدلا من إدخال التحيز المرحلة، ضغط الغرفة أو حقن النيتروجين المترجمة لتقليل تراكم تهمة على سطح الكتلة، فمن الممكن أيضا لزيادة الموصلية من الراتنج عن طريق إدخال الكربون إلى مزيج الراتنج السماح لإعدادات التصوير أكثر عدوانية16. البروتوكول العام التالي هو تكييف لبروتوكول Deerinck et al. الذي نشر في عام 2010 ويغطي التعديلات على منهجيات إعداد الأنسجة والتصوير التي وجدناها مفيدة لتقليل شحن الأنسجة مع الحفاظ على اكتساب صورة عالية الدقة3و17و18و19. في حين أن البروتوكول المذكور سابقا ركز على معالجة الأنسجة وتلقيح المعادن الثقيلة ، يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في سير عمل التصوير وتحليل البيانات وإعادة الإعمار المتأصل في دراسات SBF-SEM. في مختبرنا، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح واستنساخ على مجموعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك القرنية وهياكل الجزء الأمامي، الجفن، الغدة الكظرية والأصعب، شبكية العين والعصب البصري، القلب، الرئة والمجرى الهوائي، الكلى، الكبد، عضلة كريماستر، والقشرة الدماغية / النخاع، وفي مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الماوس، الفئران، الأرانب، خنزير غينيا، الأسماك، أحادي الطبقة وثقافات الخلايا الطبقية، الخنزير، الرئيسيات غير البشرية، وكذلك الإنسان20،21،22،23. في حين أن التغييرات الصغيرة قد تكون جديرة بالاهتمام بالنسبة لأنسجة وتطبيقات محددة ، فقد أثبت هذا البروتوكول العام أنه قابل للاستنساخ ومفيد للغاية في سياق منشأة التصوير الأساسية لدينا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

يسمح المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) بجمع مئات إلى آلاف الصور فائقة الهيكلة المسجلة بشكل متسلسل ، مما يوفر رؤية ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة لاستئصال الأنسجة الدقيقة. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه. يستفيد نظام التصوير هذا من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد. ومع ذلك، دون إعداد الأنسجة المناسبة البنية الفوقية الخلوية يمكن تغييرها بطريقة يمكن استخلاص استنتاجات غير صحيحة أو مضللة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء الصور عن طريق مسح الوجه الكتلي لعينة بيولوجية مضمنة في الراتنج، وهذا غالبا ما يمثل تحديات واعتبارات يجب معالجتها. تراكم الإلكترونات داخل الكتلة أثناء التصوير، والمعروفة باسم "شحن الأنسجة"، يمكن أن يؤدي إلى فقدان التباين وعدم القدرة على تقدير الهيكل الخلوي. وعلاوة على ذلك، في حين أن زيادة كثافة شعاع الإلكترون / الجهد أو خفض سرعة مسح شعاع يمكن أن تزيد من دقة الصورة، وهذا يمكن أن يكون أيضا الآثار الجانبية المؤسفة من إتلاف كتلة الراتنج وتشويه الصور اللاحقة في سلسلة التصوير. هنا نقدم بروتوكول روتيني لإعداد عينات الأنسجة البيولوجية التي تحافظ على البنية الفوقية الخلوية ويقلل من شحن الأنسجة. كما نقدم اعتبارات التصوير للحصول السريع على صور تسلسلية عالية الجودة مع الحد الأدنى من الضرر لكتلة الأنسجة.

ماوس كورنيا تم تطبيق هذا البروتوكول بشكل مكثف على قرنية الماوس. باستخدام التصوير SBF-SEM شبكة من حزم الألياف الدقيقة الخالية من الإيلاستين (EFMBs) تبين أن تكون موجودة داخل القرنية الماوس الكبار. وكان يعتقد في السابق أن هذه الشبكة لم تكن موجودة إلا أثناء النمو الجنيني والمبكر بعد الول?...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

يحدد هذا البروتوكول طريقة روتينية لاستخدام المجهر الإلكتروني للمسح التسلسلي لوجه الكتلة (SBF-SEM)، وهي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد قوية. يعتمد التطبيق الناجح ل SBF-SEM على تقنيات التثبيت وتلطيخ الأنسجة المناسبة ، بالإضافة إلى النظر بعناية في إعدادات التصوير. ويتضمن هذا البروتوكول اعتبارات عملية لهذه العملية برمتها.

المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

يوفر المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي رؤية غير مسبوقة للهياكل فائقة الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، ويمكن الإجابة على مجموعة من الأسئلة التي كانت مستحيلة في السابق أو صعبة للغاية. تسمح هذه التقنية بالإنتاج السريع والتكرار لمجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد مع الحد الأدنى من شحن الأنسجة والتحف. والأهم من ذلك ، فإنه يسمح بالتقاط تلقائي لآلاف الصور يوميا.يوفر المجهر الإلكتروني القياسي للإرسال بنية فائقة خلوية ممتازة. ومع ذلك، تفتقر هذه الصور إلى سياق ثلاثي الأبعاد، وقد يكون من الصعب تفسيرها. المتسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني يوفر هذا السياق ثلاثي الأبعاد، مما يسمح لتفسير العمليات المعقدة.وفي حين أن هذا البروتوكول موثوق وقابل للاستنساخ، فإن بعض الخطوات تتطلب الدقة وهي ذات أهمية حاسمة لنجاح هذه المنهجية. سيوضح هذا الفيديو هذه الخطوات الهامة بالتفصيل. بعد تحديد عينات في 0.1 صوديوم الأضراس cacodylate العازلة، التي تحتوي على 2.5٪ غلوتارالدهيد، واثنين من كلوريد الكالسيوم ملليمولار، وينبغي قطع العينات إلى كتل لا يزيد حجمها عن ملليمترين مكعبات، وغسلها مع 0.1 الصبار الصوديوم الضرس العازلة التي تحتوي على اثنين من كلوريد الكالسيوم ملليمولار.ثم يتم تلطخ الأنسجة بالتتابع مع فيروكيانيد أوسميوم، ثيوكاربوهيدرازايد، وتيتروكسيد أوسميوم. بعد حضانة أكسيد الأوسميوم، عالج الأنسجة بخلات أورانيل مائي بنسبة 1٪ عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، حل 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 ملليلتر من محلول حمض الأسبارتيك الضرس 0.03، واستخدام واحد هيدروكسيد البوتاسيوم العادي لضبط درجة الحموضة من محلول الأسبارتات الرصاص والتون إلى 5.5.بعد تسخين المحلول في الفرن ، اغسل الأنسجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل غسل في درجة حرارة الغرفة ، والمياه المقطرة المزدوجة ، قبل نقل الأنسجة إلى درجة حرارة 60 درجة مئوية أدفأ محلول الأسبارتات الرصاصي ل والتون لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اغسل الأنسجة وجففها في سلسلة أسيتون صاعدة باردة، تليها حضانة لمدة 10 دقائق في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنسجة في نسبة 1:3 من الراتنج المختلط الصلب في الأسيتون لمدة أربع ساعات من التسلل على منصة دوارة ، تليها تسلل لمدة ثماني ساعات أو بين عشية وضحاها في نسبة 1:1 من الراتنج إلى محلول الأسيتون على منصة دوارة ، ثم تسلل بين عشية وضحاها في نسبة 3:1 من الراتنج إلى الأسيتون على المنصة الدوارة.في صباح اليوم التالي، التسلل إلى الأنسجة في الراتنج الطازجة 100٪لمدة أربع إلى ثماني ساعات، واحدة بين عشية وضحاها، وتسلل واحد لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة على منصة الدورية. في صباح اليوم التالي، استخدم عصا خشبية لخلط كمية صغيرة من الراتنج مع مسحوق أسود الكربون حتى يتم تشبع الراتنج مع مسحوق، ولكن لا يزال السائل ولا تصبح محبب. يجب أن يشبه السكن الحبر السميك ، وأن يكون قادرا على التنقيط ببطء دون كتل مرئية ضع عينة الأنسجة في قالب مطاطي من السيليكون ، والتقاط صورة للرجوع إليها لاحقا من اتجاه العينة داخل كتلة الراتنج.عندما تكون العينة في مكانها، قم بتغطية الأنسجة في الراتنج المشبع الأسود الكربوني في طرف قالب السيليكون، مع التسمية التي تشير إلى التفاصيل التجريبية والأنسجة في القالب في الطرف المقابل من الراتنج. ثم ضع القالب في فرن 65 درجة مئوية على منحدر لمدة ساعة تقريبا. عندما يكون الكربون الأسود المشبع الراتنج قد شفي بما فيه الكفاية، وإزالة القالب من الفرن، وبدءا من بئر فارغة، وملء ما تبقى من القالب مع الراتنج واضحة، مع الحرص على أن التسمية لا تزال مرئية.عندما يتم تغطية العينة مع الراتنج واضحة، وضع قالب السيليكون مرة أخرى في فرن 65 درجة مئوية، وليس على المنحدر، لمدة 48 ساعة، ثم إزالة القالب. لإعداد كتلة للتصوير، ووضع العينة الراتنج جزءا لا يتجزأ على تشاك microtome مع نهاية مدبب الشائكة ما يقرب من خمسة إلى ستة ملليمترات من تشاك. قفل العينة في مكان مع المسمار مجموعة، ووضع العينة تحت مصباح الحرارة.بعد عدة دقائق، ضع تشاك في حامل مجهر ستيريو، واستخدام جديد، شفرة حلاقة ذات حدين لجعل أقسام رقيقة موازية لوجه كتلة حتى الأنسجة مرئية، والتي سوف تكون أقل عاكسة وحبيبية بالمقارنة مع أجزاء من الراتنج التي تخلو من الأنسجة. تأمين دبوس عينة الألومنيوم في حامل دبوس التشذيب، وجعل العديد من الخدوش العميقة، متقاطعة في وجه دبوس لتوفير مساحة أكبر للغراء المستخدمة لعقد العينة في مكانها. ضع العينة تحت مصباح حراري ، وادفع شفرة الحلاقة من ملليمتر إلى ملليمترين مباشرة إلى أسفل في كتلة الراتنج قبل إجراء قطع ثاني عمودي من العمق المتساوي في الكتلة ، لتقليم الراتنج الزائد من عينة الأنسجة بحيث يبلغ قطر الكتلة حوالي ثلاثة ملليمترات من قبل اثنين إلى ثلاثة ملليمترات في الارتفاع.بعد هذا التشذيب الأولي، قم بتسخين الكتلة تحت مصباح الحرارة مرة أخرى، واستخدم شفرة حلاقة جديدة ذات حدين لقطع الجزء العلوي من كتلة الراتنج ما يقرب من ملليمتر واحد تحت الجزء المشذب في قطع واحد ناعم. ضع حامل دبوس التشذيب ، الذي يحتوي على دبوس الألومنيوم المقطوع ، في وعاء المنظار المجسم ، وطبق طبقة رقيقة من الغراء السماوي على الوجه الدبوس بحيث يغطي الدبوس تماما دون تشكيل الغضروف المفصلي المرئي. استخدم ملقط للضغط على قطعة من كتلة الأنسجة قلصت على وسط الوجه دبوس عينة لعدة ثوان، والسماح للغراء لتعيين لعدة دقائق.عندما يجف الغراء تماما، حدد موقع الأنسجة على الجزء الذي تم رفعه من كتلة الراتنج، واستخدام شفرة حلاقة ذات حدين لتقليم الجزء المرفوع من الراتنج الذي يحتوي على عينة الأنسجة إلى منطقة لا تزيد مساحتها عن ملليمتر مربع واحد. ببطء وبعناية، وإزالة أكبر قدر ممكن من الراتنج الزائد، وترك كتلة أطول قليلا في بعد واحد، واستخدام ملف معدني النهائي لزاوية الراتنج الزائد في المنطقة خارج الجزء الذي أثار يحتوي على عينة الأنسجة وصولا الى حافة دبوس. إزالة جزيئات الراتنج والغبار من العينة المعدة قبل تطبيق طبقة رقيقة من الطلاء الفضي والذهب البصق على سطح كتلة العينة بأكملها.بعد الطلاء، وتقليم أي الطلاء الفضة الزائدة من أسطح الوجه كتلة، ووضع كتلة شنت وقلصت في نهاية لمبة من أنبوب ماصة نقل حسب الطلب مع التسمية المناسبة المرفقة. باستخدام التصوير SBF-SEM، تم تحديد شبكة من حزم الألياف الدقيقة الخالية من الإيلاستين داخل قرنية الفئران البالغة. يتم تنظيم هذه الشبكة في طبقات متميزة ، مع الألياف المرتبطة ارتباطا وثيقا مع الخلايا القرنية ، حتى ملقاة داخل التشنج الضحلة على سطح القرنية.وقد أدى تطبيق هذا البروتوكول إلى اكتشاف مجموعة غير معروفة من الأعصاب القرنية المركزية التي تنصهر مع الخلايا الظهارية القاعدية على الحدود الظهارية السترومال. يكشف تصوير SBF-SEM للقرنية المركزية عن وجود الأوعية الدموية الحوفية ، وحزم الأعصاب ، والخلايا المرتبطة بها التي يمكن تقسيمها يدويا لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد. تتضمن بعض المزالق في إجراء التصوير هذا استخدام وقت سكن بكسل طويل جدا ، والذي يمكن أن يسبب صورا لاحقة متموجة ومشوهة ، وتفريغات صغيرة من الإلكترونات من وجه الكتلة ، مما يؤدي إلى تغييرات سريعة في التباين في الخطوط أو خدوش سكين على وجه الكتلة بسبب سكين معطوب أو تراكم الحطام على حافة السكين ، والتحف من شعاع الإلكترون الموسعة التركيز على وجه كتلة في حين أن العينة لا تزال في غرفة التصوير، تثبيت الأنسجة غير لائق، مما يؤدي إلى فصل الهياكل الخلوية والأنسجة الضامة، وتخطي الصورة نتيجة لكمية كبيرة من الشحن داخل كتلة الأنسجة أو الراتنج.عند قطع كتلة الأنسجة، من المهم أن يكون لديك فهم جيد للمكان الذي تقع فيه الأنسجة داخل الكتلة، وذلك لعدم تقليم بطريق الخطأ بعيدا أي مناطق عينة هامة. إذا رغبت في صور عالية الدقة لهياكل أو تفاعلات خلوية محددة ، يمكن إيقاف التصوير ، وإزالة الكتلة من المجهر ، وقطع المقاطع على بروتين فائق حيث يمكن مشاهدتها في المجهر الإلكتروني الإرسال المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني يسمح رؤية فريدة تماما من الأنسجة البيولوجية. باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من الحصول بسرعة على مجموعات بيانات عالية الجودة، وتوسيع نطاق الأنسجة التي يمكننا استكشافها.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

الدراسات المستهدفة باستخدام الوجه كتلة المسلسل ومركزة أيون شعاع المسح المجهري الإلكترون

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

سير عمل التصوير المقطعي للصفيف للحصول المستهدف على معلومات الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...