Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
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我们要感谢萨姆·汉隆博士、伊芙琳·布朗和玛格丽特·贡多博士提供的优秀技术援助。这项研究部分得到了国家卫生研究院（NIH）R01 EY-018239和P30 EY007551（国家眼科研究所）的支持，部分得到了狮子视力基金会的支持，部分得到了NIH 1R15 HD084262-01（国家儿童健康与人类发展研究所）的支持。

所有动物均按照视觉和眼科研究协会《视觉和眼科研究声明》和休斯顿大学光学学院动物处理指南中描述的指南处理。所有动物程序均由处理机构批准：鼠、鼠、兔、豚鼠和非人类灵长类动物程序均由休斯顿大学动物护理和使用委员会批准，斑马鱼程序由德保大学动物护理和使用委员会批准，猪程序由贝勒医学院动物护理和使用委员会批准。所有人体组织均按照《赫尔辛基关于人体组织研究的宣?...

本文的目的是突出组织制备和成像方法，使我们的实验室能够可靠地捕获高分辨率串行电子显微镜图像，并指出导致这一结果的关键步骤以及进行 SBF-SEM 成像时可能发生的潜在陷阱。使用此协议的成功需要正确固定组织、将重金属浸渍到样品中、修改嵌入树脂以减少充电，以及了解用于收集图像的显微镜和成像设置。格言，"质量在，质量出"是SBF-SEM成像的合适公理。由于 SBF-SEM 的目标通常是对超?...

1981年，莱顿首次描述了串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM），他设计了一个扫描电子显微镜，该显微镜由内置的显微原子增强，可以切割和成像嵌入树脂中的组织薄部分。不幸的是，技术限制限制其使用导电样品，因为非导电样品，如生物组织积累不可接受的充电水平（电子积累在组织样本）1。虽然用蒸发的碳减少组织充电在切割之间涂上块面，但这大大增加了成像采集时间和图像存储仍然是一个问题，因为当时的计算机技术不足以管理设备创建的大文件大小。2004年，登克和霍斯特曼使用装有可变压力室2的SBF-SEM重新审视了这一方法。这允许将水蒸气引入成像室，从而减少样品内部的充电，使非导电样品的成像可行，尽管图像分辨率会丢失。组织制备和成像方法的进一步改进现在允许使用高真空成像，SBF-SEM成像不再依赖水蒸气来消散充电3，4，5，6，7，8，9。虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。
SBF-SEM 允许自动收集数千个串行注册的电子显微镜图像，平面分辨率小至 3-5 nm10，11。组织，浸渍重金属和嵌入树脂，被放置在扫描电子显微镜（SEM）内，其中含有装有钻石刀的超微观。平坦的表面用钻石刀切割，刀被收回，块的表面被扫描在一个带电子束的刺刀图案中，以创建组织超结构的图像。然后，该块在 z 轴中提升指定量（例如 100 nm），称为"z 步"，在重复过程之前切割新表面。这样，当组织被切断时，会产生一个三维（3D）图像块。此成像系统进一步受益于设备的自动化性质，使显微镜在成像过程中无人看管，一天内可以自动收集数百张图像。
虽然SBF-SEM成像主要使用背散射电子形成块面图像，但二次电子是在成像过程中产生的。次要电子可以积累，与背散射和原光束电子一起，无法逃离方块，并产生"组织充电"，这可能导致块面的局部静电场。这种电子积累可以扭曲图像或导致电子从方块中弹出，并有助于后散射探测器收集的信号，降低信号与噪声的比例13。虽然通过降低电子束电压或强度或减少光束停留时间可以降低组织充电水平，但这会导致信号与噪声比减少 14。当使用低电压或强度的电子束，或者光束只允许在每个像素空间内停留较短的时间时，从组织中弹出的背散电子较少，并被电子探测器捕获，导致信号较弱。Denk 和 Horstmann 通过将水蒸气引入室内来解决这个问题，从而以图像分辨率为代价降低了房间和块面的电荷。由于腔室压力为10-100 Pa，电子束的一部分是分散的，导致图像噪声和分辨率的丧失，然而，这也产生离子在标本室中和电荷在样品块2。在成像过程中，样品块内的中和电荷使用焦气喷射到块面上，或将负电压引入SBF-SEM阶段，以降低探针束拉升能量，增加收集的信号6、7、15。与其引入阶段偏置、腔室压力或局部氮注入来减少块表面的电荷积聚，还可以通过将碳引入树脂混合物来增加树脂的导电性，从而允许更积极的成像设置16。以下一般协议是2010年发布的Deerinck等人协议的改编，涵盖了对组织制备和成像方法的修改，我们发现在保持高分辨率图像采集3、17、18、19的同时，最大限度地减少组织充电是有用的。虽然前面提到的协议侧重于组织处理和重金属浸渍，但该协议提供了对 SBF-SEM 研究固有的成像、数据分析和重建工作流程的洞察。在我们的实验室中，此协议已成功并可重复应用于各种组织，包括角膜和前段结构， 眼睑，胆小和硬质腺，视网膜和视神经，心脏，肺和气道，肾脏，肝脏，肌骨质，和大脑皮层/梅杜拉，并在各种物种，包括老鼠，大鼠，兔子，豚鼠，鱼，单层和分层细胞培养，猪，非人类灵长类动物，以及人类20，21，22，23。虽然对于特定的组织和应用来说，小的变化可能是值得的，但事实证明，在我们核心成像设施的背景下，此通用协议具有高度可复制性和有用性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 可收集数百到数千张连续注册的超结构图像，为组织显微解剖提供前所未有的三维视图。虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。此成像系统受益于设备的自动化性质，允许显微镜在成像过程中无人看管，并在一天内自动收集数百张图像。然而，如果没有适当的组织制备，细胞超结构可能会被改变，以得出不正确或误导性的结论。此外，图像是通过扫描树脂嵌入生物样本的块面生成的，这通常会带来必须解决的挑战和考虑。成像过程中块内电子的积累，称为"组织充电"，可导致对比度损失和无法欣赏细胞结构。此外，虽然增加电子束强度/电压或降低光束扫描速度可以增加图像分辨率，但这也可能产生破坏树脂块和扭曲成像系列中后续图像的不幸副作用。在这里，我们提出了一个常规协议，准备生物组织样本，以保持细胞超结构和减少组织充电。我们还为快速获取高质量的序列图像提供成像考虑，对组织块的损害最小。

鼠标科内亚 此协议已广泛应用于小鼠角膜。使用 SBF-SEM 成像，显示成人小鼠角膜内存在无弹性蛋白微纤维束 （EFMB） 网络。以前认为，该网络仅在胚胎和产后早期发育期间存在。SBF-SEM 揭示了整个角膜中广泛的 EFMB 网络，在横截面测量时，发现单个纤维的直径为 100-200 nm。还发现，这个EFMB网络是组织在不同的层，纤维与角细胞紧密相连，甚至躺在角细胞表面的浅入侵（<strong class="xf...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

该协议概述了使用串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 的常规方法，这是一种强大的 3D 成像技术。SBF-SEM 的成功应用取决于适当的固定和组织染色技术，以及仔细考虑成像设置。本协议包含整个过程的实际考虑。

生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

串行块面扫描电子显微镜提供了前所未有的三维组织超结构视图，可以回答许多以前不可能或极其难以追求的问题。该技术允许快速和可重复地生产具有最小组织充电和人工制品的三维数据集。更重要的是，它允许每天自动捕获数千张图像。标准传输电子显微镜提供出色的蜂窝超结构。但是，这些图像缺乏三维上下文，可能难以解释。串行块面扫描电子显微镜提供了三维上下文，允许对复杂过程进行解释。虽然此协议是可靠且可重复的，但某些步骤需要精确性，并且对于此方法的成功至关重要。此视频将详细演示这些关键步骤。将样品固定在含有2.5%谷氨酸和2毫升氯化钙的0.1摩尔碳酸钠缓冲液中后，样品应切成不超过两毫米的方块，用含有两毫米氯化钙的0.1摩尔钠可可酸酸钠缓冲液清洗。然后，组织按顺序沾染铁氰化钠、硫化氢和二氧化硫化钠。在二氧化钠孵育后，在4摄氏度的温度下用1%的尿素醋酸盐治疗组织。第二天早上，溶解0.066克硝酸铅在10毫升0.03摩尔阿斯巴酸溶液中，并使用一种普通氢氧化钾将沃尔顿铅分方溶液的pH值调整为5.5。在烤箱中加热溶液后，每次在室温下洗涤五次，每次洗涤三分钟，双蒸馏水，然后将组织转移到 60 摄氏度加热 Walton 的铅分离溶液中，在 60 摄氏度下加热 30 分钟。在孵化结束时，洗涤组织，使其脱水，在上升的冰冷的乙酮系列中，然后在室温乙酮中孵育10分钟。然后将组织置于血酮中硬混合树脂的 1：3 比例中，在旋转平台上渗透 4 小时，然后在旋转平台上以 1：1 的树脂与 Acetone 溶液的比例进行 8 小时或夜间渗透，然后在旋转平台上以 3：1 的比例对树脂与 Acetone 进行夜间渗透。第二天早上，在旋转平台上，在室温下以100%树脂渗透组织，进行4至8小时、1个通宵和4小时室温渗透。第二天早上，用木棍将少量树脂与炭黑粉混合，直到树脂与粉末饱和，但仍是液体，不会变粒状。住宅应类似于厚墨水，并且能够在没有可见团的情况下缓慢滴落 将组织样本置于硅橡胶模具中，并捕获图像，以便以后参考树脂块内的样品方向。当样品到位时，覆盖硅胶模具末端碳黑饱和树脂中的组织，标签指示树脂另一端的模具中的实验和组织细节。然后，将模具放入 65 摄氏度的烤箱中，在斜坡上放置约一小时。当碳黑注入树脂已充分固化，从烤箱中取出霉菌，并开始与空井，填充模具的其余部分与透明树脂，注意标签保持可见。当样品被透明树脂覆盖时，将硅胶模具放回 65 摄氏度的烤箱中，而不是倾斜，48 小时，然后去除霉菌。要准备成像块，将树脂嵌入的标本放在一个微原子夹头上，锥形末端从夹头中伸出大约五到六毫米。用螺丝将标本锁定到位，并将标本置于热灯下。几分钟后，将夹头放入立体显微镜支架中，并使用新的双刃剃须刀刀片使薄块与块面平行，直到组织可见，与没有组织的树脂部分相比，反射和粒状的要小一些。在修剪销架中固定铝标本销，并在针脚表面制作几个深而纵横交错的划痕，为用于固定标本的胶水提供更大的表面积。将标本放在热灯下，将剃须刀直接推入树脂块，然后进行第二次垂直切入块中，以修剪组织样本中多余的树脂，使该块直径约为三毫米，高度为两到三毫米。进行初始修剪后，再次加热热灯下的方块，并使用新的双刃剃须刀刀片在单次平滑切割中将树脂块的顶部切开约一毫米。将包含切割铝销的修剪销架放在立体显微镜插座中，并将薄薄的氰丙烯酸胶粘在销面上，使其完全覆盖销，而不会形成可见的半月板。使用钳子将修剪过的组织块压在标本针面的中心几秒钟，并让胶水固定几分钟。当胶水彻底干燥后，将组织定位在树脂块的凸起部分，并使用双刃剃须刀将含有组织样本的树脂的凸起部分修剪到不超过一平方毫米的区域。慢慢地小心地去除尽可能多的过量树脂，使方块在一个维度上稍长一些，并使用最终的金属文件将包含组织样本的凸起部分以外的区域的多余树脂向下倾斜到针脚边缘。在将薄薄的银漆和金色溅到整个样品块表面之前，先从准备好的样品中去除树脂颗粒和灰尘。涂层后，从块面表面修剪多余的银漆，并将安装和修剪的块放在定制的转移移液管的球状末端，并附上适当的标签。利用 SBF-SEM 成像技术，在成年小鼠角膜中确定了无弹性蛋白微纤维束网络。该网络以不同的层组织，纤维与角细胞紧密相连，甚至位于角蛋白表面的浅层入侵中。该协议的应用导致发现了以前未知的中央角膜神经群，这些角膜神经与基底上皮细胞在上皮边界融合。中央角膜的 SBF-SEM 成像揭示了肢体血管、神经束和相关细胞的存在，这些细胞可以手动分割用于 3D 重建。此成像过程的一些陷阱包括使用过长的像素停留时间，这可能导致后续图像波浪和扭曲，从块面小放电的电子，导致线条的快速对比变化，刀划痕块面由于损坏的刀或碎片堆积在刀的边缘，当样品仍在成像室中时，来自扩展电子束的人工制品聚焦在块面上，组织固定不当，导致细胞结构和结缔组织分离，以及组织内大量充电或树脂块导致图像跳过。切割组织块时，必须很好地了解组织位于块内的位置，以免意外地修剪掉任何重要的样本区域。如果需要特定细胞结构或相互作用的更高分辨率图像，则可以停止成像，从显微镜中取出方块，并在超显微镜上切割部分，以便在传输电子显微镜中查看这些图像，连续块面扫描电子显微镜可完全独到地查看生物组织。使用此协议，我们能够快速获取高质量的数据集，并扩展我们可以探索的组织范围。

Research

JoVE Journal

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