Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

We willen Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown en Margaret Gondo bedanken voor hun uitstekende technische assistentie. Dit onderzoek werd deels ondersteund door National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 en P30 EY007551 (National Eye Institute), deels door de Lion's Foundation for Sight, en deels door NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Alle dieren werden behandeld volgens de richtlijnen beschreven in de Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research en de University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de instellingen waar ze werden behandeld: muis-, ratten-, konijnen-, cavia- en niet-menselijke primatenprocedures werden goedgekeurd door de University of Houston Animal Care and Use Committee, zebravisprocedures wer...

Het doel van dit methodedocument is om de weefselvoorbereidings- en beeldvormingsmethodologie te benadrukken die ons lab in staat heeft gesteld om op betrouwbare wijze seriële elektronenmicroscopiebeelden met hoge resolutie vast te leggen, en om te wijzen op kritieke stappen die tot dit resultaat leiden, evenals mogelijke valkuilen die kunnen optreden bij het uitvoeren van SBF-SEM-beeldvorming. Succes met behulp van dit protocol vereist een goede fixatie van weefsel, impregnatie van zware metalen in het monster, wijzigi...

Serial block face scanning electron microscopie (SBF-SEM) werd voor het eerst beschreven door Leighton in 1981, waar hij een scanning elektronenmicroscoop maakte, aangevuld met een ingebouwde microtome die dunne delen weefsel ingebed in hars kon snijden en in beeld kon snijden. Helaas beperkten technische beperkingen het gebruik ervan tot geleidende monsters, omdat niet-geleidende monsters zoals biologisch weefsel onaanvaardbare oplaadniveaus (elektronenopbouw in het weefselmonster)1. Terwijl het coaten van de blokwand tussen sneden met verdampte koolstof verminderde weefsel opladen, deze sterk verhoogde beeldverwervingstijd en beeldopslag bleef een probleem omdat computertechnologie op dat moment onvoldoende was om de grote bestandsgroottes die door het apparaat werden gecreëerd te beheren. Deze methodiek is in 2004 door Denk en Horstmann opnieuw bekeken met behulp van een SBF-SEM uitgerust met een variabele drukkamer2. Dit maakte de introductie van waterdamp in de beeldvormingskamer mogelijk, waardoor het opladen in het monster werd beperkt, waardoor beeldvorming van niet-geleidende monsters levensvatbaar werd, zij het met verlies van beeldresolutie. Verdere verbeteringen in weefselvoorbereidings - en beeldvormingsmethoden maken het nu mogelijk om beeldvorming met behulp van hoog vacuüm mogelijk te maken, en SBF-SEM-beeldvorming is niet langer afhankelijk van waterdamp om het opladen3,4,5,6,7,8,9af te voeren . Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit.
SBF-SEM maakt de geautomatiseerde verzameling van duizenden serieel geregistreerde elektronenmicroscopiebeelden mogelijk, met een planaire resolutie van 3-5 nm10,11. Weefsel, geïmpregneerd met zware metalen en ingebed in hars, wordt geplaatst in een scanning elektronenmicroscoop (SEM) met een ultramicrotome uitgerust met een diamantmes. Een vlak oppervlak wordt gesneden met het diamantmes, het mes wordt ingetrokken en het oppervlak van het blok wordt gescand in een rasterpatroon met een elektronenstraal om een beeld van weefsel ultrastructuur te creëren. Het blok wordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid (bijv. 100 nm) in de z-as verhoogd, bekend als een "z-stap", en een nieuw oppervlak wordt gesneden voordat het proces wordt herhaald. Op deze manier wordt een 3-dimensionaal (3D) blok beelden geproduceerd terwijl het weefsel wordt weggesneden. Dit beeldvormingssysteem profiteert verder van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag.
Terwijl SBF-SEM-beeldvorming voornamelijk backscattered elektronen gebruikt om een beeld van het blokvlak te vormen, worden secundaire elektronen gegenereerd tijdens het beeldvormingsproces12. Secundaire elektronen kunnen zich ophopen, naast backscattered en primaire-bundel elektronen die niet ontsnappen aan het blok, en produceren "weefsel opladen," die kan leiden tot een gelokaliseerd elektrostatisch veld aan de block-face. Deze elektronenaccumulatie kan het beeld vervormen of ervoor zorgen dat elektronen uit het blok worden geworpen en bijdragen aan het signaal dat door de backscatterdetector wordt verzameld, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verlaagd13. Hoewel het niveau van weefsellading kan worden verlaagd door de spanning of intensiteit van de elektronenbundel te verminderen of de verblijftijd van de bundel te verkorten, resulteert dit in een verminderde signaal-ruisverhouding14. Wanneer een elektronenbundel met een lagere spanning of intensiteit wordt gebruikt, of de bundel slechts gedurende een kortere periode in elke pixelruimte mag blijven hangen, worden minder teruggetrokken elektronen uit het weefsel geworpen en door de elektronendetector opgevangen, wat resulteert in een zwakker signaal. Denk en Horstmann hebben dit probleem aangepakt door waterdamp in de kamer te brengen, waardoor de lading in de kamer en op het blokgezicht wordt verminderd ten koste van de beeldresolutie. Bij een kamerdruk van 10-100 Pa wordt een deel van de elektronenbundel verspreid, wat bijdraagt aan beeldruis en een verlies van resolutie, maar dit produceert ook ionen in de monsterkamer die de lading binnen het monsterblok neutraliseren2. Recentere methoden voor het neutraliseren van lading binnen het monsterblok gebruiken focale gasinjectie van stikstof over het blokvlak tijdens beeldvorming, of het introduceren van negatieve spanning in het SBF-SEM-stadium om de energie van de sondestraallading te verminderen en het verzamelde signaal te verhogen6,7,15. In plaats van stadiumbias, kamerdruk of gelokaliseerde stikstofinjectie te introduceren om de ladingsopbouw op het blokoppervlak te verminderen, is het ook mogelijk om de geleidbaarheid van de hars te verhogen door koolstof in de harsmix te introduceren, waardoor agressievere beeldvormingsinstellingen mogelijk zijn16. Het volgende algemene protocol is een aanpassing van het in 2010 gepubliceerde Deerinck et al.-protocol en omvat wijzigingen in weefselvoorbereidings - en beeldvormingsmethoden die we nuttig vonden voor het minimaliseren van weefselladen met behoud van beeldverwerving met hoge resolutie3,17,18,19. Hoewel het eerder genoemde protocol gericht was op weefselverwerking en impregneren van zware metalen, biedt dit protocol inzicht in de beeldvormings-, gegevensanalyse- en reconstructieworkflow die inherent is aan SBF-SEM-studies. In ons laboratorium, dit protocol is met succes en reproduceerbaar toegepast op een breed scala van weefsels, waaronder hoornvlies en voorste segment structuren, ooglid, traan en harderian klier, netvlies en oogzenuw, hart, long en luchtwegen, nier, lever, cremaster spier, en cerebrale cortex / medulla, en in een verscheidenheid van soorten, waaronder muis, rat, konijn, cavia, vis, monolayer en gelaagde celculturen, varken, niet-menselijke primaat, evenals mens2. Hoewel kleine veranderingen de moeite waard kunnen zijn voor specifieke weefsels en toepassingen, is dit algemene protocol zeer reproduceerbaar en nuttig gebleken in de context van onze kernbeeldvormingsfaciliteit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

Serial block-face scanning electron microscopie (SBF-SEM) maakt het mogelijk om honderden tot duizenden serieel geregistreerde ultrastructurele beelden te verzamelen, wat een ongekend driedimensionaal beeld biedt van weefselmicroanatomie. Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit. Dit beeldvormingssysteem profiteert van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag. Zonder de juiste weefselvoorbereiding kan de cellulaire ultrastructuur echter zodanig worden gewijzigd dat onjuiste of misleidende conclusies kunnen worden getrokken. Bovendien worden afbeeldingen gegenereerd door het blokvlak van een met hars ingebed biologisch monster te scannen en dit brengt vaak uitdagingen en overwegingen met zich mee die moeten worden aangepakt. De accumulatie van elektronen in het blok tijdens beeldvorming, bekend als "weefsel opladen", kan leiden tot een verlies van contrast en een onvermogen om cellulaire structuur te waarderen. Bovendien kan het verhogen van de intensiteit/spanning van elektronenbundels of het verlagen van de stralingsscansnelheid de beeldresolutie verhogen, maar dit kan ook de ongelukkige bijwerking hebben van het beschadigen van het harsblok en het vervormen van latere beelden in de beeldvormingsreeks. Hier presenteren we een routineprotocol voor de voorbereiding van biologische weefselmonsters die cellulaire ultrastructuur behouden en het opladen van weefsel verminderen. We bieden ook beeldvormingsoverwegingen voor de snelle verwerving van hoogwaardige seriële beelden met minimale schade aan het weefselblok.

Muis Cornea Dit protocol is uitgebreid toegepast op het hoornvlies van de muis. Met behulp van SBF-SEM-beeldvorming bleek een netwerk van elastinevrije microfibrilbundels (EFMBs) aanwezig te zijn in het volwassen muis hoornvlies. Eerder werd aangenomen dat dit netwerk alleen aanwezig was tijdens embryonale en vroege postnatale ontwikkeling. SBF-SEM onthulde een uitgebreid EFMB-netwerk in het hele hoornvlies, met individuele vezels met een diameter van 100-200 nm wanneer gemeten in doorsnede. Er werd o...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Dit protocol schetst een routinemethode voor het gebruik van seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), een krachtige 3D-beeldvormingstechniek. Succesvolle toepassing van SBF-SEM hangt af van de juiste fixatie- en weefselkleuringstechnieken, evenals zorgvuldige overweging van beeldvormingsinstellingen. Dit protocol bevat praktische overwegingen voor het gehele proces.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie biedt een ongekend beeld van driedimensionale weefsel ultra structuren, en kan een groot aantal vragen beantwoorden die voorheen onmogelijk of buitengewoon moeilijk na te streven. Deze techniek maakt de snelle en reproduceerbare productie van driedimensionale datasets mogelijk met minimale weefsellading en artefacten. En wat belangrijk is, het maakt het mogelijk om dagelijks duizenden afbeeldingen automatisch vast te leggen.Standaard transmissie elektronenmicroscopie biedt een uitstekende cellulaire ultrastructuur. Deze beelden missen echter een driedimensionale context en kunnen moeilijk te interpreteren zijn. Seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie biedt die driedimensionale context, waardoor de interpretatie van complexe processen mogelijk is.Hoewel dit protocol betrouwbaar en reproduceerbaar is, vereisen bepaalde stappen precisie en zijn ze van cruciaal belang voor het succes van deze methodologie. Deze video zal deze kritieke stappen in detail demonstreren. Na het fixeren van monsters in 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer, die 2,5% glutaraldehyde en twee millimollar calciumchloride bevat, moeten de monsters in blokken van niet meer dan twee millimeter in blokjes worden gesneden en worden gewassen met 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer die twee millimollar calciumchloride bevat.Het weefsel wordt vervolgens opeenvolgend gekleurd met osmium ferrocyanide, thiocarbohydrazide en osmiumtetroxide. Na osmiumtetroxide incubatie, behandel het weefsel met 1%waterig uranylacetaat bij vier graden Celsius 's nachts. Los de volgende ochtend 0,066 gram loodnitraat op in 10 milliliter 0,03 molaire asparaginezuuroplossing en gebruik één normaal kaliumhydroxide om de pH van de lood aspartaatoplossing van de Walton aan te passen aan 5,5.Na het opwarmen van de oplossing in de oven, was het weefsel vijf keer gedurende drie minuten per wasbeurt in kamertemperatuur, dubbel gedestilleerd water, voordat u het weefsel overbrengt in een 60 graden Celsius verwarmde Walton's lood aspartaatoplossing gedurende 30 minuten op 60 graden Celsius. Was aan het einde van de incubatie het weefsel en droog het uit in een oplopende, ijskoude acetonreeks, gevolgd door een incubatietijd van 10 minuten in aceton op kamertemperatuur. Plaats vervolgens het weefsel in een verhouding van 1:3 van hard-gemengde hars in aceton gedurende vier uur infiltratie op een roterend platform, gevolgd door een infiltratie van acht uur of 's nachts in een 1:1 verhouding hars tot acetonoplossing op een roterend platform, vervolgens een nachtelijke infiltratie in een 3:1 verhouding van hars tot aceton op het roterende platform.Infiltreer de volgende ochtend het weefsel in verse 100% hars gedurende één vier tot acht uur, één nacht en één infiltratie van vier uur bij kamertemperatuur op een roterend platform. Gebruik de volgende ochtend een houten stok om een kleine hoeveelheid hars te mengen met koolstofzwart poeder totdat de hars verzadigd is met het poeder, maar nog steeds vloeibaar is en niet korrelig wordt. De woning moet op dikke inkt lijken en langzaam kunnen druppelen zonder zichtbare klonten Plaats het weefselmonster in een siliconenrubberen mal en leg een afbeelding vast voor latere verwijzing naar de oriëntatie van het monster in het harsblok.Wanneer het monster op zijn plaats is, bedekt u het weefsel in de koolstofzwarte verzadigde hars aan de punt van de siliconenvorm, met het etiket dat de experimentele en weefseldetails in de mal aan de andere kant van de hars aangeeft. Plaats vervolgens de mal ongeveer een uur in een oven van 65 graden Celsius op een helling. Wanneer de koolstofzwarte hars voldoende is uitgehard, verwijdert u de mal uit de oven en begint u met een lege put, vult u de rest van de mal met heldere hars, waarbij u ervoor zorgt dat het etiket zichtbaar blijft.Wanneer het monster is bedekt met heldere hars, plaatst u de siliconenvorm gedurende 48 uur terug in de oven van 65 graden Celsius, niet op een helling, en verwijdert u vervolgens de mal. Om het blok voor te bereiden op beeldvorming, plaatst u het met hars ingebedde monster op een microtome-boorkop met het taps toelopende uiteinde ongeveer vijf tot zes millimeter uit de boorkop. Vergrendel het monster op zijn plaats met de ingestelde schroef en plaats het monster onder een warmtelamp.Plaats de boorkop na enkele minuten in een stereomicroscoophouder en gebruik een nieuw, dubbelzijdig scheermesje om dunne secties parallel aan het blokvlak te maken totdat het weefsel zichtbaar is, wat minder reflecterend en korrelig zal zijn in vergelijking met de delen van de hars die verstoken zijn van weefsel. Bevestig een aluminium monsterpen in de trimpenhouder en maak verschillende diepe, kriskras krassen in het gezicht van de pin om een groter oppervlak te bieden voor de lijm die wordt gebruikt om het monster op zijn plaats te houden. Plaats het monster onder een warmtelamp en duw het scheermes één tot twee millimeter recht naar beneden in het harsblok voordat u een tweede, loodrechte snede van gelijke diepte in het blok maakt, om de overtollige hars van het weefselmonster weg te snijden, zodat het blok ongeveer drie millimeter in diameter is met twee tot drie millimeter hoog.Verwarm na deze eerste trimming het blok opnieuw onder de warmtelamp en gebruik een nieuw, dubbelzijdig scheermesje om de bovenkant van het harsblok ongeveer een millimeter onder het bijgesneden gedeelte af te snijden in een enkele, gladde snede. Plaats de trimpenhouder, die de gesneden aluminium pen bevat, in de stereomicroscoophouder en breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op het penvlak, zodat deze de pin volledig bedekt zonder een zichtbare meniscus te vormen. Gebruik de tang om het bijgesneden stukje weefselblok enkele seconden op het midden van de voorkant van de monsterpen te drukken en laat de lijm enkele minuten intrekken.Wanneer de lijm grondig is gedroogd, zoekt u het weefsel op het verhoogde deel van het harsblok en gebruikt u een tweesnijdend scheermes om het verhoogde deel van de hars met het weefselmonster te trimmen tot een gebied dat niet groter is dan een vierkante millimeter. Verwijder langzaam en voorzichtig zoveel mogelijk overtollige hars, laat het blok iets langer in één dimensie achter en gebruik een laatste metalen vijl om de overtollige hars in het gebied buiten het verhoogde gedeelte met het weefselmonster naar beneden naar de rand van de pen te kantelen. Verwijder harsdeeltjes en stof uit het voorbereide monster voordat u een dunne laag zilververf en goud sputtert op het gehele oppervlak van het monsterblok.Knip na het coaten overtollige zilververf van de blokvlakoppervlakken en plaats het gemonteerde en bijgesneden blok in het bolvormige uiteinde van een op maat gemaakte transferpipetbuis met het juiste label bevestigd. Met behulp van SBF-SEM-beeldvorming is een netwerk van elastinevrije microfibrilbundels geïdentificeerd in het volwassen muis hoornvlies. Dit netwerk is georganiseerd in verschillende lagen, met de vezels nauw verbonden met keratocyten, zelfs liggend in ondiepe invaginaties op het keratocytoppervlak.Toepassing van dit protocol heeft geleid tot de ontdekking van een voorheen onbekende populatie van centrale hoornvlieszenuwen die fuseren met basale epitheelcellen aan de stromal-epitheliale grens. SBF-SEM-beeldvorming van het centrale hoornvlies onthult de aanwezigheid van limbale vasculatuur, zenuwbundels en bijbehorende cellen die handmatig kunnen worden gesegmenteerd voor 3D-reconstructie. Enkele valkuilen van deze beeldvormingsprocedure zijn het gebruik van een te lange pixel-verblijftijd, waardoor volgende beelden golvend en vervormd kunnen zijn, kleine ontladingen van elektronen uit het blokvlak, wat leidt tot snelle contrastveranderingen in lijnen, krassen van messen op het blokvlak als gevolg van een beschadigd mes of ophoping van vuil aan de rand van het mes , artefacten van een uitgebreide elektronenbundel richten zich op het blokvlak terwijl het monster zich nog in de beeldkamer bevindt, onjuiste weefselfixatie, wat leidt tot de scheiding van cellulaire structuren en bindweefsel, en beeld overslaan als gevolg van een grote hoeveelheid opladen in het weefsel of harsblok.Bij het snijden van het weefselblok is het belangrijk om een goed begrip te hebben van waar het weefsel in het blok ligt, om niet per ongeluk belangrijke monstergebieden weg te knippen. Als beelden met een hogere resolutie van specifieke cellulaire structuren of interacties gewenst zijn, kan de beeldvorming worden gestopt, het blok uit de microscoop worden verwijderd en secties op een ultramicrotome worden gesneden waar ze kunnen worden bekeken in een transmissie-elektronenmicroscoop Seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie maakt een geheel uniek beeld van biologische weefsels mogelijk. Met behulp van dit protocol zijn we in staat geweest om snel hoogwaardige datasets te verkrijgen en het bereik van weefsels dat we kunnen verkennen uit te breiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Gerichte studies met behulp van seriële blokkering en gerichte ionen straal scan elektronenmicroscopie

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Array Tomography Workflow voor de gerichte acquisitie van volume-informatie met behulp van Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...