Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
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Nous tenons à remercier M. Sam Hanlon, Evelyn Brown et Margaret Gondo pour leur excellente assistance technique. Cette recherche a été soutenue en partie par les National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 et P30 EY007551 (National Eye Institute), en partie par la Lion’s Foundation for Sight, et en partie par nih 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices décrites dans la Déclaration d’utilisation d’animaux dans la recherche sur la vision et l’ophtalmologie de l’Association for Research in Vision and Ophthalmic Research et dans les lignes directrices sur la manipulation des animaux du College of Optometry de l’Université de Houston. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par les établissements dans lesquels elles ont été manipulées : les procédures rela...

Le but de cet article de méthodes est de mettre en évidence la méthodologie de préparation et d’imagerie des tissus qui a permis à notre laboratoire de capturer de manière fiable des images de microscopie électronique série à haute résolution, et de souligner les étapes critiques qui mènent à ce résultat ainsi que les pièges potentiels qui peuvent survenir lors de la réalisation de l’imagerie SBF-SEM. Le succès de l’utilisation de ce protocole nécessite une fixation appropriée des tissus, l’imp...

La microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM) a été décrite pour la première fois par Leighton en 1981 où il a façonné un microscope électronique à balayage augmenté d’un microtome intégré qui pourrait couper et imager de fines sections de tissu incorporées dans la résine. Malheureusement, des limitations techniques ont limité son utilisation aux échantillons conducteurs, car les échantillons non conducteurs tels que les tissus biologiques accumulaient des niveaux inacceptables de charge (accumulation d’électrons dans l’échantillon tissulaire)1. Bien que le revêtement de la face de bloc entre les coupures avec une charge tissulaire réduite en carbone évaporé ait considérablement augmenté, cela a considérablement augmenté le temps d’acquisition d’images et le stockage d’images est resté un problème car la technologie informatique à l’époque était insuffisante pour gérer les grandes tailles de fichiers créées par l’appareil. Cette méthodologie a été revisitée par Denk et Horstmann en 2004 à l’aide d’un SBF-SEM équipé d’une chambre à pression variable2. Cela a permis l’introduction de vapeur d’eau dans la chambre d’imagerie, ce qui réduit la charge dans l’échantillon, rendant l’imagerie des échantillons non conducteurs viable, bien qu’avec une perte de résolution d’image. D’autres améliorations dans la préparation des tissus et les méthodes d’imagerie permettent maintenant l’imagerie à l’aide du vide élevé, et l’imagerie SBF-SEM ne repose plus sur la vapeur d’eau pour dissiper la charge3,4,5,6,7,8,9. Tandis que SBF-SEM a vu une augmentation exponentielle de l’utilisation ces dernières années, les aspects techniques tels que la préparation appropriée de tissu et les paramètres d’imagerie sont primordiaux pour le succès de cette modalité d’imagerie.
SBF-SEM permet la collecte automatisée de milliers d’images de microscopie électronique enregistrées en série, avec une résolution plane aussi petite que 3-5 nm10,11. Les tissus, imprégnés de métaux lourds et incorporés dans de la résine, sont placés dans un microscope électronique à balayage (MEB) contenant un ultramicrotome muni d’un couteau à diamant. Une surface plane est coupée avec le couteau diamant, le couteau est rétracté et la surface du bloc est scannée dans un motif raster avec un faisceau d’électrons pour créer une image de l’ultrastructure tissulaire. Le bloc est ensuite soulevé une quantité spécifiée (par exemple, 100 nm) dans l’axe z, connu sous le nom de « z-step », et une nouvelle surface est coupée avant que le processus ne soit répété. De cette façon, un bloc d’images en 3 dimensions (3D) est produit lorsque le tissu est coupé. Ce système d’imagerie bénéficie en outre de la nature automatisée de l’appareil, permettant de laisser le microscope sans surveillance pendant le processus d’imagerie, avec la collecte automatisée de centaines d’images possible en une seule journée.
Alors que l’imagerie SBF-SEM utilise principalement des électrons rétrodiffusés pour former une image de la face de bloc, des électrons secondaires sont générés au cours du processus d’imagerie12. Les électrons secondaires peuvent s’accumuler, aux côtés des électrons rétrodiffusés et à faisceau primaire qui ne s’échappent pas du bloc, et produire une « charge tissulaire », ce qui peut conduire à un champ électrostatique localisé au niveau de la face du bloc. Cette accumulation d’électrons peut déformer l’image ou provoquer l’éjection d’électrons du bloc et contribuer au signal collecté par le détecteur de rétrodiffusion, diminuant ainsi le rapport signal/bruit13. Alors que le niveau de charge tissulaire peut être diminué en réduisant la tension ou l’intensité du faisceau d’électrons, ou en réduisant le temps d’arrêt du faisceau, il en résulte une diminution du rapport signal sur bruitde 14. Lorsqu’un faisceau d’électrons de tension ou d’intensité inférieure est utilisé, ou que le faisceau n’est autorisé à demeurer dans chaque espace de pixel que pendant une période plus courte, moins d’électrons rétrodiffusés sont éjectés du tissu et capturés par le détecteur d’électrons, ce qui entraîne un signal plus faible. Denk et Horstmann ont résolu ce problème en introduisant de la vapeur d’eau dans la chambre, réduisant ainsi la charge dans la chambre et sur la face de bloc au détriment de la résolution d’image. Avec une pression de chambre de 10-100 Pa, une partie du faisceau d’électrons est diffusée contribuant au bruit de l’image et à une perte de résolution, mais cela produit également des ions dans la chambre d’éprouvette qui neutralise la charge à l’intérieur du bloc d’échantillon2. Des méthodes plus récentes pour neutraliser la charge dans le bloc d’échantillon utilisent l’injection focale de gaz d’azote sur la face du bloc lors de l’imagerie, ou l’introduction d’une tension négative à l’étage SBF-SEM pour diminuer l’énergie de la sonde-faisceau-ladage et augmenter le signal collecté6,7,15. Plutôt que d’introduire un biais d’étape, une pression de chambre ou une injection localisée d’azote pour diminuer l’accumulation de charge sur la surface du bloc, il est également possible d’augmenter la conductivité de la résine en introduisant du carbone dans le mélange de résine permettant des réglages d’imagerie plus agressifs16. Le protocole général suivant est une adaptation du protocole de Deerinck et al. publié en 2010 et couvre les modifications apportées aux méthodologies de préparation et d’imagerie des tissus que nous avons trouvées utiles pour minimiser la charge tissulaire tout en maintenant l’acquisition d’images à haute résolution3,17,18,19. Tandis que le protocole mentionné précédemment s’est concentré sur le traitement de tissu et l’imprégnation de métaux lourds, ce protocole fournit un aperçu dans l’imagerie, l’analyse de données, et le flux de travail de reconstruction inhérent aux études de SBF-SEM. Dans notre laboratoire, ce protocole a été appliqué avec succès et reproductiblement à une grande variété de tissus, y compris la cornée et les structures du segment antérieur, la paupière, la glande lacrymale et plus dure, la rétine et le nerf optique, le cœur, le poumon et les voies respiratoires, les reins, le foie, le muscle crémaster et le cortex cérébral / médulle, et dans une variété d’espèces, y compris la souris, le rat, le lapin, le cobaye, le poisson, la monocouche et les cultures cellulaires stratifiées, le porc, le primate non humain, ainsi que l’homme20,21,22,23. Bien que de petits changements puissent être utiles pour des tissus et des applications spécifiques, ce protocole général s’est avéré hautement reproductible et utile dans le contexte de notre installation d’imagerie de base.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

La microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM) permet la collecte de centaines à des milliers d’images d’ultrastructure série-enregistrées, offrant une vue tridimensionnelle sans précédent de la microanatomie de tissu. Tandis que SBF-SEM a vu une augmentation exponentielle de l’utilisation ces dernières années, les aspects techniques tels que la préparation appropriée de tissu et les paramètres d’imagerie sont primordiaux pour le succès de cette modalité d’imagerie. Ce système d’imagerie bénéficie de la nature automatisée de l’appareil, permettant de laisser le microscope sans surveillance pendant le processus d’imagerie, avec la collecte automatisée de centaines d’images possible en une seule journée. Cependant, sans préparation tissulaire appropriée, l’ultrastructure cellulaire peut être modifiée de telle sorte que des conclusions incorrectes ou trompeuses puissent être tirées. De plus, les images sont générées en scannant la face d’îlot d’un échantillon biologique incorporé dans la résine, ce qui présente souvent des défis et des considérations qui doivent être abordés. L’accumulation d’électrons dans le bloc pendant l’imagerie, connue sous le nom de « charge tissulaire », peut entraîner une perte de contraste et une incapacité à apprécier la structure cellulaire. De plus, bien que l’augmentation de l’intensité/tension du faisceau d’électrons ou la diminution de la vitesse de balayage du faisceau puisse augmenter la résolution de l’image, cela peut également avoir l’effet secondaire malheureux d’endommager le bloc de résine et de déformer les images suivantes dans la série d’imagerie. Ici, nous présentons un protocole de routine pour la préparation d’échantillons de tissus biologiques qui préserve l’ultrastructure cellulaire et diminue la charge tissulaire. Nous fournissons également des considérations d’imagerie pour l’acquisition rapide d’images série de haute qualité avec des dommages minimaux au bloc tissulaire.

Cornée de souris Ce protocole a été largement appliqué à la cornée de souris. Utilisant la formation image de SBF-SEM un réseau des paquets sans élastine de microfibrille (EFMBs) se sont avérés présents dans la cornée adulte de souris. On croyait auparavant que ce réseau n’était présent que pendant le développement embryonnaire et postnatal précoce. SBF-SEM a indiqué un réseau étendu d’EFMB dans toute la cornée, avec les différentes fibres avérées pour être 100-200 nanomè...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Ce protocole décrit une méthode de routine pour l’utilisation de la microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM), une technique d’imagerie 3D puissante. L’application réussie de SBF-SEM s’articule sur la fixation appropriée et les techniques de souillure de tissu, aussi bien que l’examen soigneux des arrangements de formation image. Ce protocole contient des considérations pratiques pour l’ensemble de ce processus.

Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

La microscopie électronique périodique de balayage de bloc-visage fournit une vue sans précédent des structures ultra tridimensionnelles de tissu, et peut répondre à une foule de questions précédemment impossibles ou excessivement difficiles à poursuivre. Cette technique permet la production rapide et reproductible de jeux de données tridimensionnels avec une charge tissulaire et des artefacts minimaux. Et surtout, il permet la capture automatisée de milliers d’images par jour.La microscopie électronique à transmission standard fournit une excellente structure ultra cellulaire. Cependant, ces images manquent de contexte tridimensionnel et peuvent être difficiles à interpréter. La microscopie électronique à balayage de bloc-face série fournit ce contexte tridimensionnel, permettant l’interprétation de processus complexes.Bien que ce protocole soit fiable et reproductible, certaines étapes nécessitent de la précision et sont d’une importance cruciale pour le succès de cette méthodologie. Cette vidéo démontrera ces étapes critiques en détail. Après avoir fixé des échantillons dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 molaire, contenant 2,5 % de glutaraldéhyde, et deux chlorures de calcium millimolaires, les échantillons doivent être coupés en blocs ne dépassant pas deux millimètres cubes et lavés avec un tampon de cacodylate de sodium molaire 0,1 contenant deux chlorures de calcium millimolaires.Le tissu est ensuite coloré séquentiellement avec du ferrocyanure d’osmium, du thiocarbohydrazide et du tétroxyde d’osmium. Après incubation du tétroxyde d’osmium, traiter le tissu avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1% à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, dissoudre 0,066 gramme de nitrate de plomb dans 10 millilitres de solution d’acide aspartique molaire à 0,03 et utiliser un hydroxyde de potassium normal pour ajuster le pH de la solution d’aspartate de plomb de Walton à 5,5.Après avoir réchauffé la solution au four, lavez le tissu cinq fois pendant trois minutes par lavage à température ambiante, à l’eau doublement distillée, avant de transférer le tissu dans une solution d’aspartate de plomb de Walton réchauffée à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez le tissu et déshydratez-le dans une série ascendante d’acétone glacée, suivie d’une incubation de 10 minutes dans de l’acétone à température ambiante. Placez ensuite le tissu dans un rapport 1:3 de résine dure mélangée dans l’acétone pendant quatre heures d’infiltration sur une plate-forme rotative, suivie d’une infiltration de huit heures ou de nuit dans un rapport 1:1 de résine à solution d’acétone sur une plate-forme rotative, puis d’une infiltration pendant la nuit dans un rapport 3:1 de résine à l’acétone sur la plate-forme rotative.Le lendemain matin, infiltrez le tissu dans de la résine fraîche à 100% pendant une infiltration de quatre à huit heures, une pendant une nuit et une infiltration de quatre heures à température ambiante sur une plate-forme rotative. Le lendemain matin, utilisez un bâton en bois pour mélanger une petite quantité de résine avec de la poudre de noir de carbone jusqu’à ce que la résine soit saturée de poudre, mais reste fluide et ne devienne pas granuleuse. La résidence doit ressembler à de l’encre épaisse et pouvoir s’égoutter lentement sans touffes visibles Placer l’échantillon de tissu dans un moule en caoutchouc de silicone et capturer une image pour référence ultérieure de l’orientation de l’échantillon dans le bloc de résine.Lorsque l’échantillon est en place, couvrir le tissu dans la résine saturée de noir de carbone à l’extrémité du moule en silicone, avec l’étiquette indiquant les détails expérimentaux et tissulaires dans le moule à l’extrémité opposée de la résine. Ensuite, placez le moule dans un four à 65 degrés Celsius à une inclinaison d’environ une heure. Lorsque la résine infusée au noir de carbone a suffisamment durci, retirez le moule du four et commencez par un puits vide, remplissez le reste du moule avec de la résine claire, en prenant soin que l’étiquette reste visible.Lorsque l’échantillon a été recouvert de résine transparente, replacez le moule en silicone dans le four à 65 degrés Celsius, et non sur une pente, pendant 48 heures, puis retirez le moule. Pour préparer le bloc pour l’imagerie, placez l’échantillon en résine incorporé sur un mandrin à microtome dont l’extrémité conique colle à environ cinq à six millimètres du mandrin. Verrouillez l’échantillon en place avec la vis de réglage et placez l’échantillon sous une lampe chauffante.Après plusieurs minutes, placez le mandrin dans un support de stéréomicroscope et utilisez une nouvelle lame de rasoir à double tranchant pour créer de fines sections parallèles à la face du bloc jusqu’à ce que le tissu soit visible, ce qui sera moins réfléchissant et granulaire par rapport aux parties de la résine dépourvues de tissu. Fixez une goupille d’échantillon en aluminium dans le support de goupille de coupe et faites plusieurs rayures profondes et entrecroisantes à la face de la goupille pour fournir une plus grande surface pour la colle utilisée pour maintenir l’échantillon en place. Placez l’échantillon sous une lampe chauffante et poussez le rasoir d’un à deux millimètres directement dans le bloc de résine avant de faire une deuxième coupe perpendiculaire de profondeur égale dans le bloc, pour couper l’excès de résine de l’échantillon de tissu de sorte que le bloc mesure environ trois millimètres de diamètre par deux à trois millimètres de hauteur.Après cette coupe initiale, réchauffez à nouveau le bloc sous la lampe chauffante et utilisez une nouvelle lame de rasoir à double tranchant pour couper le haut du bloc de résine à environ un millimètre en dessous de la partie coupée en une seule coupe lisse. Placez le support de goupille de coupe, contenant la goupille en aluminium coupée, dans le réceptacle de stéréomicroscope, et appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la face de la goupille de sorte qu’elle recouvre complètement la goupille sans former de ménisque visible. Utilisez une pince pour appuyer sur le morceau de bloc de tissu taillé sur le centre de la face de la goupille de l’échantillon pendant plusieurs secondes et laissez la colle se fixer pendant plusieurs minutes.Lorsque la colle a bien séché, localisez le tissu sur la partie surélevée du bloc de résine et utilisez un rasoir à double tranchant pour couper la partie surélevée de la résine contenant l’échantillon de tissu à une zone ne dépassant pas un millimètre carré. Lentement et soigneusement, retirez autant de résine excédentaire que possible, en laissant le bloc légèrement plus long dans une dimension, et utilisez une lime métallique finale pour incliner l’excès de résine dans la zone à l’extérieur de la partie surélevée contenant l’échantillon de tissu vers le bas vers le bord de la goupille. Enlevez les particules de résine et la poussière de l’échantillon préparé avant d’appliquer une fine couche de peinture argentée et de pulvérisation d’or sur toute la surface du bloc d’échantillonnage.Après le revêtement, coupez tout excès de peinture argentée des surfaces de face du bloc et placez le bloc monté et garni à l’extrémité bulbeuse d’un tube de pipette de transfert sur mesure avec l’étiquette appropriée attachée. Utilisant la formation image SBF-SEM, un réseau de paquets sans élastine de microfibrille ont été identifiés dans la cornée adulte de souris. Ce réseau est organisé en couches distinctes, avec les fibres étroitement associées aux kératocytes, se trouvent même dans des invaginations peu profondes à la surface des kératocytes.L’application de ce protocole a mené à la découverte d’une population précédemment inconnue des nerfs cornéens centraux qui fusionnent avec les cellules épithéliales basiques à la frontière stromal-épithéliale. La formation image de SBF-SEM de la cornée centrale indique la présence de la vascularisation limbal, des paquets de nerf, et des cellules associées qui peuvent être manuellement segmentées pour la reconstruction 3D. Certains pièges de cette procédure d’imagerie incluent l’utilisation d’un temps d’arrêt de pixel trop long, ce qui peut entraîner des images ultérieures ondulées et déformées, de petites décharges d’électrons de la face de bloc, conduisant à des changements de contraste rapides dans les lignes, des rayures de couteau sur la face de bloc en raison d’un couteau endommagé ou une accumulation de débris sur le bord du couteau , les artefacts d’un faisceau d’électrons étendu se concentrent sur la face de bloc alors que l’échantillon est encore dans la chambre d’imagerie, une fixation incorrecte des tissus, conduisant à la séparation des structures cellulaires et du tissu conjonctif, et un saut d’image à la suite d’une grande quantité de charge dans le bloc de tissu ou de résine.Lors de la coupe du bloc de tissu, il est important d’avoir une bonne compréhension de l’endroit où se trouve le tissu dans le bloc, Afin de ne pas couper accidentellement les régions d’échantillon importantes. Si des images à plus haute résolution de structures cellulaires ou d’interactions spécifiques sont souhaitées, l’imagerie peut être arrêtée, le bloc retiré du microscope et des sections coupées sur un ultramicrotome où elles peuvent être visualisées dans un microscope électronique à transmission La microscopie électronique à balayage de bloc de série permet une vue tout à fait unique des tissus biologiques. Grâce à ce protocole, nous avons pu acquérir rapidement des ensembles de données de qualité et élargir la gamme de tissus que nous pouvons explorer.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

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Recherche

Biologie

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