Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
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Wir danken Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown und Margaret Gondo für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Forschung wurde teilweise von den National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 und P30 EY007551 (National Eye Institute), teilweise von der Lion's Foundation for Sight und teilweise von NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development) unterstützt.

Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien behandelt, die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research und den Richtlinien des University of Houston College of Optometry für den Umgang mit Tieren beschrieben sind. Alle Tierverfahren wurden von den Institutionen genehmigt, in denen sie behandelt wurden: Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen- und nichtmenschliche Primatenverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Univer...

Der Zweck dieses Methodenpapiers besteht darin, die Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethodik hervorzuheben, die es unserem Labor ermöglicht hat, hochauflösende serielle Elektronenmikroskopiebilder zuverlässig zu erfassen, und kritische Schritte aufzuzeigen, die zu diesem Ergebnis führen, sowie mögliche Fallstricke, die bei der Durchführung der SBF-REM-Bildgebung auftreten können. Der Erfolg mit diesem Protokoll erfordert die richtige Fixierung des Gewebes, die Imprägnierung von Schwermetallen in die Probe, Mo...

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) wurde erstmals 1981 von Leighton beschrieben, wo er ein Rasterelektronenmikroskop mit einem eingebauten Mikrotom entwickelte, das dünne Gewebeschnitte schneiden und abbilden konnte, die in Harz eingebettet waren. Leider beschränkten technische Einschränkungen die Verwendung auf leitfähige Proben, da nicht leitende Proben wie biologisches Gewebe inakzeptable Ladungsniveaus (Elektronenaufbau innerhalb der Gewebeprobe) ansammelten1. Während die Blockfläche zwischen den Schnitten mit verdampfter kohlenstoffreduzierter Gewebeladung beschichtet wurde, blieb diese stark erhöhte Bildgebungsaufnahmezeit und Bildspeicherung ein Problem, da die Computertechnologie zu dieser Zeit nicht ausreichte, um die vom Gerät erzeugten großen Dateigrößen zu verwalten. Diese Methodik wurde 2004 von Denk und Horstmann mit einem SBF-SEM mit variabler Druckkammer2überarbeitet. Dies ermöglichte die Einführung von Wasserdampf in die Bildgebungskammer, was die Aufladung innerhalb der Probe reduziert und die Bildgebung von nichtleitenden Proben möglich macht, wenn auch mit einem Verlust der Bildauflösung. Weitere Verbesserungen in der Gewebevorbereitung und bildgebenden Verfahren ermöglichen nun die Bildgebung mit Hochvakuum, und die SBF-REM-Bildgebung ist nicht mehr auf Wasserdampf angewiesen, um die Ladung3,4,5, 6,7,8,9abzuleiten . Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung.
SBF-SEM ermöglicht die automatisierte Erfassung von Tausenden von seriell registrierten Elektronenmikroskopiebildern mit einer planaren Auflösung von nur 3-5 nm10,11. Gewebe, das mit Schwermetallen imprägniert und in Harz eingebettet ist, wird in ein Rasterelektronenmikroskop (REM) gelegt, das ein ultramikrotom mit einem Diamantmesser enthält. Eine ebene Oberfläche wird mit dem Diamantmesser geschnitten, das Messer wird zurückgezogen und die Oberfläche des Blocks wird in einem Rastermuster mit einem Elektronenstrahl gescannt, um ein Bild der Gewebe-Ultrastruktur zu erstellen. Der Block wird dann um eine bestimmte Menge (z. B. 100 nm) in der z-Achse angehoben, die als "z-Schritt" bezeichnet wird, und eine neue Oberfläche wird geschnitten, bevor der Vorgang wiederholt wird. Auf diese Weise wird ein 3-dimensionaler (3D) Bildblock erzeugt, während das Gewebe weggeschnitten wird. Dieses Bildgebungssystem profitiert zusätzlich von der automatisierten Natur des Geräts, so dass das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt gelassen werden kann, wobei die automatisierte Sammlung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist.
Während die SBF-REM-Bildgebung in erster Linie rückgestreute Elektronen verwendet, um ein Bild der Blockfläche zu bilden, werden während des Bildgebungsprozesses Sekundärelektronen erzeugt12. Sekundärelektronen können sich neben rückgestreuten und Primärstrahlelektronen, die dem Block nicht entkommen, ansammeln und eine "Gewebeladung" erzeugen, die zu einem lokalisierten elektrostatischen Feld an der Blockfläche führen kann. Diese Elektronenakkumulation kann das Bild verzerren oder dazu führen, dass Elektronen aus dem Block ausgestoßen werden und zum vom Rückstreudetektor gesammelten Signal beitragen, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis13verringert wird. Während das Niveau der Gewebeladung durch Verringerung der Elektronenstrahlspannung oder -intensität oder durch Verkürzung der Strahlverweilzeit verringert werden kann, führt dies zu einem verringerten Signal-Rausch-Verhältnis14. Wenn ein Elektronenstrahl mit geringerer Spannung oder Intensität verwendet wird oder der Strahl nur für einen kürzeren Zeitraum in jedem Pixelraum verweilen darf, werden weniger rückgestreute Elektronen aus dem Gewebe ausgestoßen und vom Elektronendetektor eingefangen, was zu einem schwächeren Signal führt. Denk und Horstmann lösten dieses Problem, indem sie Wasserdampf in die Kammer einführten und so die Ladung in der Kammer und auf der Blockfläche auf Kosten der Bildauflösung reduzierten. Bei einem Kammerdruck von 10-100 Pa wird ein Teil des Elektronenstrahls gestreut, was zu Bildrauschen und Auflösungsverlust beiträgt, dies erzeugt jedoch auch Ionen in der Probenkammer, die die Ladung innerhalb des Probenblocks2neutralisieren. Neuere Methoden zur Neutralisierung der Ladung innerhalb des Probenblocks verwenden die fokale Gasinjektion von Stickstoff über die Blockfläche während der Bildgebung oder die Einführung negativer Spannung in die SBF-REM-Stufe, um die Sondenstrahl-Lading-Energie zu verringern und das gesammelte Signal zu erhöhen6,7,15. Anstatt Stufenvorspannung, Kammerdruck oder lokalisierte Stickstoffinjektion einzuführen, um den Ladungsaufbau auf der Blockoberfläche zu verringern, ist es auch möglich, die Leitfähigkeit des Harzes zu erhöhen, indem Kohlenstoff in die Harzmischung eingeführt wird, was aggressivere Bildgebungseinstellungen ermöglicht16. Das folgende allgemeine Protokoll ist eine Adaption des 2010 veröffentlichten Deerinck et al.-Protokolls und deckt Modifikationen an Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethoden ab, die wir für die Minimierung der Gewebeaufladung bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der hochauflösenden Bilderfassung für nützlich hielten3,17,18,19. Während sich das zuvor erwähnte Protokoll auf die Gewebeverarbeitung und Schwermetallimprägnierung konzentrierte, bietet dieses Protokoll Einblicke in den Bildgebungs-, Datenanalyse- und Rekonstruktionsworkflow, der SBF-SEM-Studien innewohnt. In unserem Labor wurde dieses Protokoll erfolgreich und reproduzierbar auf eine Vielzahl von Geweben angewendet, darunter Hornhaut- und Vordersegmentstrukturen, Augenlid, Tränen- und Härterdrüse, Netzhaut und Sehnerv, Herz, Lunge und Atemwege, Niere, Leber, Cremaster-Muskel und Großhirnrinde / Medulla sowie in einer Vielzahl von Arten wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Fisch, Monoschicht- und Stratifizierte Zellkulturen, Schwein, nichtmenschliche Primaten sowie Menschen20,21,22,23. Während sich kleine Änderungen für bestimmte Gewebe und Anwendungen lohnen können, hat sich dieses allgemeine Protokoll im Kontext unserer Core Imaging Facility als sehr reproduzierbar und nützlich erwiesen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) ermöglicht die Erfassung von Hunderten bis Tausenden von seriell registrierten ultrastrukturellen Bildern und bietet eine beispiellose dreidimensionale Ansicht der Gewebemikroanatomie. Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung. Dieses Bildgebungssystem profitiert von der automatisierten Natur des Geräts, so dass man das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt lassen kann, wobei die automatisierte Erfassung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist. Ohne entsprechende Gewebevorbereitung kann die zelluläre Ultrastruktur jedoch so verändert werden, dass falsche oder irreführende Rückschlüsse gezogen werden können. Darüber hinaus werden Bilder durch Scannen der Blockfläche einer in Harz eingebetteten biologischen Probe erzeugt, was oft Herausforderungen und Überlegungen mit sich bringt, die angegangen werden müssen. Die Ansammlung von Elektronen innerhalb des Blocks während der Bildgebung, bekannt als "Gewebeladung", kann zu einem Kontrastverlust und einer Unfähigkeit führen, die Zellstruktur zu schätzen. Während eine Erhöhung der Elektronenstrahlintensität / -spannung oder die Verringerung der Strahlabtastgeschwindigkeit die Bildauflösung erhöhen kann, kann dies auch den unglücklichen Nebeneffekt haben, den Harzblock zu beschädigen und nachfolgende Bilder in der Bildgebungsserie zu verzerren. Hier stellen wir ein Routineprotokoll für die Vorbereitung biologischer Gewebeproben vor, das die zelluläre Ultrastruktur bewahrt und die Gewebeladung verringert. Wir bieten auch bildgebende Überlegungen für die schnelle Aufnahme von qualitativ hochwertigen Serienbildern mit minimaler Schädigung des Gewebeblocks.

Maus Hornhaut Dieses Protokoll wurde ausgiebig auf die Hornhaut der Maus angewendet. Mit Hilfe der SBF-SEM-Bildgebung wurde gezeigt, dass ein Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillenbündeln (EFMBs) in der erwachsenen Maushornhaut vorhanden ist. Bisher glaubte man, dass dieses Netzwerk nur während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung vorhanden war. SBF-SEM zeigte ein ausgedehntes EFMB-Netzwerk in der gesamten Hornhaut, wobei einzelne Fasern bei Der Messung im Querschnitt einen Durchme...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Dieses Protokoll beschreibt eine Routinemethode für die Verwendung der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM), einer leistungsstarken 3D-Bildgebungstechnik. Die erfolgreiche Anwendung von SBF-SEM hängt von der richtigen Fixierung und Gewebefärbung sowie der sorgfältigen Berücksichtigung der Bildgebungseinstellungen ab. Dieses Protokoll enthält praktische Überlegungen für den gesamten Prozess.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie bietet einen beispiellosen Blick auf dreidimensionale Gewebe-Ultrastrukturen und kann eine Vielzahl von Fragen beantworten, die bisher unmöglich oder äußerst schwierig zu beantworten waren. Diese Technik ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Produktion dreidimensionaler Datensätze mit minimaler Gewebeaufladung und Artefakten. Und vor allem ermöglicht es die automatisierte Erfassung von Tausenden von Bildern täglich.Die Standard-Transmissionselektronenmikroskopie bietet eine hervorragende zelluläre Ultrastruktur. Diesen Bildern fehlt jedoch ein dreidimensionaler Kontext und sie können schwer zu interpretieren sein. Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie liefert diesen dreidimensionalen Kontext, der die Interpretation komplexer Prozesse ermöglicht.Während dieses Protokoll zuverlässig und reproduzierbar ist, erfordern bestimmte Schritte Präzision und sind für den Erfolg dieser Methodik von entscheidender Bedeutung. Dieses Video zeigt diese kritischen Schritte im Detail. Nach der Fixierung der Proben in 0,1 molaren Natriumcodylatpuffer, der 2,5% Glutaraldehyd und zwei millimolares Calciumchlorid enthält, sollten die Proben in Blöcke geschnitten werden, die nicht größer als zwei Millimeter sind, gewürfelt und mit 0,1 molaren Natriumkacodylatpuffer gewaschen werden, der zwei millimolares Calciumchlorid enthält.Das Gewebe wird dann nacheinander mit Osmiumferrocyanid, Thiocarbohydrazid und Osmiumtetroxid gefärbt. Nach der Osmiumtetroxid-Inkubation das Gewebe über Nacht mit 1% wässrigem Uranylacetat bei vier Grad Celsius behandeln. Am nächsten Morgen lösen Sie 0,066 Gramm Bleinitrat in 10 Millilitern 0,03 molarer Asparaginsäurelösung und verwenden sie ein normales Kaliumhydroxid, um den pH-Wert der Walton-Bleiaspartatlösung auf 5,5 einzustellen.Nachdem Sie die Lösung im Ofen erwärmt haben, waschen Sie das Gewebe fünfmal für drei Minuten pro Wäsche bei Raumtemperatur, doppelt destilliertes Wasser, bevor Sie das Gewebe für 30 Minuten bei 60 Grad Celsius in eine 60 Grad Celsius warme Walton-Bleiaspartatlösung für 30 Minuten bei 60 Grad Celsius überführen. Am Ende der Inkubation das Gewebe waschen und in einer aufsteigenden, eiskalten Acetonserie dehydrieren, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in Aceton bei Raumtemperatur. Dann legen Sie das Gewebe in einem Verhältnis von 1: 3 von hartgemischten Harz in Aceton für vier Stunden Infiltration auf einer rotierenden Plattform, gefolgt von einer achtstündigen oder nächtlichen Infiltration in einem 1: 1-Verhältnis von Harz zu Acetonlösung auf einer rotierenden Plattform, dann eine Nachtinfiltration in einem 3: 1-Verhältnis von Harz zu Aceton auf der rotierenden Plattform.Am nächsten Morgen infiltrieren Sie das Gewebe in frischem 100% Harz für eine vier- bis achtstündige, eine über Nacht und eine vierstündige Infiltration bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform. Verwenden Sie am nächsten Morgen einen Holzstab, um eine kleine Menge Harz mit Rußpulver zu mischen, bis das Harz mit dem Pulver gesättigt ist, aber immer noch flüssig ist und nicht körnig wird. Die Residenz sollte dicker Tinte ähneln und in der Lage sein, langsam ohne sichtbare Klumpen zu tropfen Legen Sie die Gewebeprobe in eine Silikonkautschukform und nehmen Sie ein Bild für eine spätere Referenz der Probenorientierung innerhalb des Harzblocks auf.Wenn die Probe an Ort und Stelle ist, bedecken Sie das Gewebe mit dem rußgesättigten Harz an der Spitze der Silikonform, wobei das Etikett die experimentellen und Gewebedetails in der Form am gegenüberliegenden Ende des Harzes anzeigt. Dann legen Sie die Form für etwa eine Stunde in einen 65-Grad-Celsius-Ofen mit einer Steigung. Wenn das mit Ruß angereicherte Harz ausreichend ausgehärtet ist, entfernen Sie die Form aus dem Ofen und füllen Sie den Rest der Form mit klarem Harz, wobei Sie darauf achten, dass das Etikett sichtbar bleibt.Wenn die Probe mit klarem Harz bedeckt wurde, legen Sie die Silikonform für 48 Stunden wieder in den 65-Grad-Celsius-Ofen, nicht auf einer Steigung, und entfernen Sie dann die Form. Um den Block für die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie die in Harz eingebettete Probe auf ein Mikrotomfutter, wobei das konische Ende etwa fünf bis sechs Millimeter aus dem Futter herausklebt. Verriegeln Sie die Probe mit der Stellschraube an Ort und Stelle und legen Sie die Probe unter eine Wärmelampe.Nach einigen Minuten legen Sie das Futter in einen Stereomikroskophalter und verwenden Sie eine neue, zweischneidige Rasierklinge, um dünne Abschnitte parallel zur Blockfläche zu machen, bis das Gewebe sichtbar ist, das im Vergleich zu den Teilen des Harzes, die ohne Gewebe sind, weniger reflektierend und körnig ist. Befestigen Sie einen Aluminiumprobenstift im Trimmstifthalter und machen Sie mehrere tiefe, kreuz und quer verlaufende Kratzer in der Vorderseite des Stifts, um eine größere Oberfläche für den Klebstoff zu schaffen, der zum Halten der Probe an Ort und Stelle verwendet wird. Legen Sie die Probe unter eine Wärmelampe und drücken Sie den Rasierer ein bis zwei Millimeter direkt in den Harzblock, bevor Sie einen zweiten, senkrechten Schnitt gleicher Tiefe in den Block machen, um das überschüssige Harz von der Gewebeprobe wegzuschneiden, so dass der Block etwa drei Millimeter durchmessern und zwei bis drei Millimeter hoch ist.Erwärmen Sie nach diesem ersten Trimmen den Block erneut unter der Wärmelampe und schneiden Sie mit einer neuen, zweischneidigen Rasierklinge die Oberseite des Harzblocks etwa einen Millimeter unter dem beschnittenen Teil in einem einzigen, glatten Schnitt ab. Legen Sie den Trimmstifthalter, der den geschnittenen Aluminiumstift enthält, in die Stereomikroskopbuchse und tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Stiftfläche auf, so dass er den Stift vollständig bedeckt, ohne einen sichtbaren Meniskus zu bilden. Verwenden Sie eine Pinzette, um das getrimmte Stück Gewebeblock für einige Sekunden auf die Mitte der Probenstiftfläche zu drücken, und lassen Sie den Kleber einige Minuten einwirken.Wenn der Kleber gründlich getrocknet ist, lokalisieren Sie das Gewebe auf dem erhöhten Teil des Harzblocks und schneiden Sie den erhöhten Teil des Harzes, der die Gewebeprobe enthält, mit einem zweischneidigen Rasierer auf eine Fläche von nicht mehr als einem Quadratmillimeter. Entfernen Sie langsam und vorsichtig so viel überschüssiges Harz wie möglich, lassen Sie den Block in einer Dimension etwas länger und verwenden Sie eine endgültige Metallfeile, um das überschüssige Harz in dem Bereich außerhalb des erhöhten Teils, der die Gewebeprobe enthält, zum Rand des Stifts zu winkeln. Entfernen Sie Harzpartikel und Staub aus der vorbereiteten Probe, bevor Sie eine dünne Schicht Silberfarbe und Goldsputtern auf die gesamte Probenblockoberfläche auftragen.Schneiden Sie nach der Beschichtung überschüssige Silberfarbe von den Blockflächen ab und legen Sie den montierten und beschnittenen Block in das bauchige Ende eines maßgeschneiderten Transferpipettenrohrs mit dem entsprechenden Etikett. Mit Hilfe der SBF-SEM-Bildgebung wurde ein Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillenbündeln in der erwachsenen Maushornhaut identifiziert. Dieses Netzwerk ist in verschiedenen Schichten organisiert, wobei die Fasern eng mit Keratozyten verbunden sind und sogar in flachen Invaginationen auf der Keratozytenoberfläche liegen.Die Anwendung dieses Protokolls hat zur Entdeckung einer bisher unbekannten Population zentraler Hornhautnerven geführt, die mit basalen Epithelzellen an der Stroma-Epithel-Grenze verschmelzen. Die SBF-SEM-Bildgebung der zentralen Hornhaut zeigt das Vorhandensein von limbalen Vaskulaturen, Nervenbündeln und zugehörigen Zellen, die für die 3D-Rekonstruktion manuell segmentiert werden können. Einige Fallstricke dieses bildgebenden Verfahrens sind die Verwendung einer zu langen Pixelverweilzeit, die dazu führen kann, dass nachfolgende Bilder wellig und verzerrt sind, kleine Entladungen von Elektronen aus der Blockfläche, die zu schnellen Kontraständerungen der Linien führen, Messerkratzer auf der Blockfläche aufgrund eines beschädigten Messers oder Ablagerungen am Rand des Messers Artefakte aus einem ausgedehnten Elektronenstrahl konzentrieren sich auf die Blockfläche, während sich die Probe noch in der Bildgebungskammer befindet, unsachgemäße Gewebefixierung, die zur Trennung von Zellstrukturen und Bindegewebe führt, und Bildüberspringen als Folge einer großen Menge an Aufladung innerhalb des Gewebes oder Harzblocks.Beim Schneiden des Gewebeblocks ist es wichtig, ein gutes Verständnis dafür zu haben, wo sich das Gewebe innerhalb des Blocks befindet, um nicht versehentlich wichtige Probenregionen wegzuschneiden. Wenn höher aufgelöste Bilder bestimmter zellulärer Strukturen oder Wechselwirkungen gewünscht werden, kann die Bildgebung gestoppt, der Block aus dem Mikroskop entfernt und Abschnitte auf einem Ultramikrotom geschnitten werden, wo sie in einem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet werden können Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie ermöglicht eine völlig einzigartige Sicht auf biologische Gewebe. Mit diesem Protokoll konnten wir schnell qualitativ hochwertige Datensätze erfassen und die Palette der Gewebe, die wir erforschen können, erweitern.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Forschung

Biologie

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Gezielte Studien mit serial Block Face und Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...