Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר סם הנלון, אוולין בראון ומרגרט גונדו על הסיוע הטכני המצוין שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 EY-018239 ו P30 EY007551 (המכון הלאומי לבריאות הילד), בין השאר על ידי קרן האריה למראה, ובחלקו על ידי NIH 1R15 HD084262-01 (המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם).

כל בעלי החיים טופלו על פי ההנחיות המתוארות בהצהרת האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים בראייה ומחקר עיניים ובהנחיות הטיפול בבעלי חיים של מכללת יוסטון לאופטומטריה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי המוסדות שבהם הם טופלו: עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, נהלי פרימטים שאינם אנושיים א?...

מטרת נייר שיטות זה היא להדגיש את הכנת הרקמות ואת מתודולוגיית ההדמיה שאיפשרה למעבדה שלנו ללכוד באופן אמין תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים סדרתיות ברזולוציה גבוהה, ולהצביע על צעדים קריטיים שמובילים לתוצאה זו, כמו גם מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הדמיית SBF-SEM. הצלחה בשימוש בפר?...

בלוק סדרתי פנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) תואר לראשונה על ידי לייטון בשנת 1981 שבו הוא עיצב מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה בתוספת מיקרוטום מובנה אשר יכול לחתוך תמונה חלקים דקים של רקמה מוטבע שרף. למרבה הצער, מגבלות טכניות הגבילו את השימוש בו לדגימות מוליכות, שכן דגימות לא מוליכות כגון רקמה ביולוגית צברו רמות בלתי קבילות של טעינה (הצטברות אלקטרונים בתוך דגימת הרקמה)1. בעוד ציפוי הפנים בלוק בין חתכים עם פחמן התאדה מופחת טעינת רקמות, זה גדל מאוד זמן רכישת הדמיה ואחסון תמונה נשאר בעיה כמו טכנולוגיית המחשב באותו זמן לא היה מספיק כדי לנהל את גדלי הקבצים הגדולים שנוצרו על ידי המכשיר. מתודולוגיה זו נבחנה מחדש על ידי דנק והורסטמן בשנת 2004 באמצעות SBF-SEM המצויד בתא לחץ משתנה2. זה איפשר הכנסת אדי מים לתא ההדמיה אשר מפחית את הטעינה בתוך המדגם, מה שהופך את ההדמיה של דגימות לא מוליך קיימא אם כי עם אובדן רזולוציית תמונה. שיפורים נוספים בשיטות הכנת רקמות והדמיה מאפשרים כעת הדמיה באמצעות ואקום גבוה, והדמיה SBF-SEM כבר לא מסתמכת על אדי מים כדי לפזר טעינה3,4,5,6,7,8,9. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו.
SBF-SEM מאפשר איסוף אוטומטי של אלפי תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הרשומות באופן סדרתי, עם רזולוציה מישורית קטנה כמו 3-5 ננומטר10,11. רקמה, ספוגה במתכות כבדות ומוטבעת שרף, ממוקמת בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) המכיל ultramicrotome מצויד בסכין יהלום. משטח שטוח נחתך עם סכין היהלומים, הסכין נסוגה, ומשטח הבלוק נסרק בתבנית רסטר עם קרן אלקטרונים כדי ליצור תמונה של מבנה רקמות. לאחר מכן הבלוק מועלה סכום שצוין (למשל, 100 ננומטר) בציר z, המכונה "z-step", ומשטח חדש נחתך לפני שהתהליך חוזר על עצמו. בדרך זו בלוק תלת מימדי (3D) של תמונות מופק כמו הרקמה נחתכת. מערכת הדמיה זו נהנית עוד יותר מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד.
בעוד הדמיית SBF-SEM משתמשת בעיקר אלקטרונים backscattered כדי ליצור תמונה של פני הבלוק, אלקטרונים משניים נוצרים במהלך תהליך ההדמיה12. אלקטרונים משניים יכולים להצטבר, לצד אלקטרונים עם קורות אחוריות ופני קרן ראשונית שאינם נמלטים מהחסימה, ומייצרים "טעינת רקמות", מה שעלול להוביל לשדה אלקטרוסטטי מקומי בפני הבלוק. הצטברות אלקטרונים זו יכולה לעוות את התמונה או לגרום אלקטרונים להיפלט מהבלוק ולתרום לאות שנאסף על ידי גלאי backscatter, הפחתת יחס אות לרעש13. בעוד שניתן להפחית את רמת טעינת הרקמות על ידי הפחתת המתח או העוצמה של קרן האלקטרונים, או הפחתת זמן השתהות בקרן, התוצאה היא יחס אות לרעש מופחת14. כאשר נעשה שימוש בקרן אלקטרונים במתח נמוך יותר או בעוצמה נמוכה יותר, או כאשר הקרן רשאית להתעכב בתוך כל מרחב פיקסלים רק לפרק זמן קצר יותר, אלקטרונים פחות מכווצים לאחור נפלטים מהרקמה ונלכדים על ידי גלאי האלקטרונים וכתוצאה מכך אות חלש יותר. דנק והורסטמן התמודדו עם בעיה זו על ידי החדרת אדי מים לתא, ובכך להפחית את המטען בתא ועל פני הבלוק במחיר של רזולוציית תמונה. עם לחץ תא של 10-100 Pa, חלק מקרן האלקטרונים מפוזר תורם רעש תמונה ואובדן רזולוציה, אולם זה גם מייצר יונים בתא הדגימה אשר מנטרל תשלום בתוך בלוק מדגם2. שיטות עדכניות יותר לנטרול מטען בתוך בלוק המדגם להשתמש הזרקת גז מוקדי של חנקן על פני הבלוק במהלך ההדמיה, או החדרת מתח שלילי לשלב SBF-SEM כדי להקטין את האנרגיה מטען קרן בדיקה ולהגדיל את האות שנאסף6,7,15. במקום להציג הטיית במה, לחץ תאי או הזרקת חנקן מקומית כדי להפחית את הצטברות הטעינה על משטח הבלוק, ניתן גם להגדיל את המוליכות של השרף על ידי החדרת פחמן לתערובת השרף המאפשרת הגדרות הדמיה אגרסיביות יותר16. הפרוטוקול הכללי הבא הוא התאמה של פרוטוקול Deerinck et al. שפורסם בשנת 2010 ומכסה שינויים במתודולוגיות הכנת רקמות והדמיה שמצאנו שימושי למזעור טעינת רקמות תוך שמירה על רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה3,17,18,19. בעוד שהפרוטוקול שהוזכר לעיל התמקד בעיבוד רקמות ובהסתמעת מתכות כבדות, פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי זרימת העבודה של ההדמיה, ניתוח הנתונים והשחזור הטבועה במחקרי SBF-SEM. במעבדה שלנו, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה ובאופן שכפול על מגוון רחב של רקמות כולל קרנית ומבני קטעים לפני השימוש, עפעפיים, בלוטות קריליות וקשות יותר, רשתית ועצב הראייה, לב, ריאות ודרכי הנשימה, כליות, כבד, שריר קרמאסטר וקליפת המוח /medulla, ובמגוון מינים כולל עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, דגים, מונולאייר ותרביות תאים מרובדות, חזיר, פרימטים לא אנושיים, כמו גם בניאדם 20,21,22,23. בעוד שינויים קטנים עשויים להיות כדאי עבור רקמות ויישומים ספציפיים, פרוטוקול כללי זה הוכיח מאוד לשחזור ושימושי בהקשר של מתקן ההדמיה הליבה שלנו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתי (SBF-SEM) מאפשר איסוף של מאות עד אלפי תמונות אולטרה-מבניות הרשומות באופן סדרתי, ומציע תצוגה תלת מימדית חסרת תקדים של מיקרואנטומיה של רקמות. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו. מערכת הדמיה זו נהנית מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד. עם זאת, ללא הכנת רקמות מתאימה אולטרה מובנה הסלולר ניתן לשנות באופן כזה מסקנות שגויות או מטעות עשוי להסיק. בנוסף, תמונות נוצרות על ידי סריקת פני הבלוק של מדגם ביולוגי מוטבע שרף וזה לעתים קרובות מציג אתגרים ושיקולים שיש לטפל בהם. הצטברות אלקטרונים בתוך הבלוק במהלך ההדמיה, המכונה "טעינת רקמות", עלולה להוביל לאובדן ניגודיות ולחוסר יכולת להעריך את המבנה התאי. יתר על כן, בעוד הגדלת עוצמת קרן אלקטרונים / מתח או הפחתת מהירות סריקת קרן יכול להגביר את רזולוציית התמונה, זה יכול להיות גם תופעת לוואי מצערת של פגיעה בלוק שרף ועיוות התמונות הבאות בסדרת ההדמיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול שגרתי להכנת דגימות רקמה ביולוגית המשמרת את המבנה התאי ומפחיתה את טעינת הרקמות. כמו כן, אנו מספקים שיקולי הדמיה לרכישה מהירה של תמונות סדרתיות באיכות גבוהה עם נזק מינימלי לגוש הרקמות.

עכבר קרנית פרוטוקול זה הוחל בהרחבה על הקרנית של העכבר. באמצעות SBF-SEM הדמיה רשת של חבילות microfibril נטול אלסטין (EFMBs) הוצגו להיות נוכח בתוך הקרנית העכבר הבוגר. בעבר האמינו כי רשת זו הייתה נוכחת רק במהלך התפתחות עוברית ותחילת הלידה. SBF-SEM חשף רשת EFMB נרחבת ברחבי הקרנית, עם סיבים בודדים שנמצ...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

פרוטוקול זה מתאר שיטה שגרתית לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים טורי (SBF-SEM), טכניקת הדמיה תלת-ממדית רבת עוצמה. יישום מוצלח של צירי SBF-SEM על קיבוע נאות וטכניקות כתמי רקמות, כמו גם שיקול זהיר של הגדרות הדמיה. פרוטוקול זה מכיל שיקולים מעשיים לממותו של תהליך זה.

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתי מספק תצוגה חסרת תקדים של מבנים אולטרה רקמות תלת מימדיים, והוא יכול לענות על שורה של שאלות בעבר בלתי אפשרי או קשה מאוד לרדוף. טכניקה זו מאפשרת ייצור מהיר וניתן לשחזור של ערכות נתונים תלת מימדיות עם טעינת רקמות מינימלית וממצאים. וחשוב מכך, זה מאפשר לכידה אוטומטית של אלפי תמונות מדי יום.מיקרוסקופ אלקטרוני שידור סטנדרטי מספק מבנה אולטרה תאי מעולה. עם זאת, תמונות אלה חסרות הקשר תלת מימדי, וקשה לפרש אותן. מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק טורי מספק הקשר תלת מימדי זה, ומאפשר פרשנות של תהליכים מורכבים.בעוד פרוטוקול זה הוא אמין לשחזור, צעדים מסוימים דורשים דיוק והם חשובים ביותר להצלחת מתודולוגיה זו. סרטון וידאו זה ידגים שלבים קריטיים אלה בפירוט. לאחר תיקון דגימות 0.1 נתרן טוחנת מאגר cacodylate, המכיל 2.5% glutaraldehyde, ושני סידן כלורי מילימולארי, דגימות צריך להיות חתוך בלוקים לא יותר משני מילימטרים קוביות, ושטף עם 0.1 חוצץ נתרן cacodylate טוחנת המכיל שני סידן כלורי מילימולארי.לאחר מכן הרקמה מוכתמת ברצף באוסמיום פרוציאניד, תיוקרבוהידראזיד ואוסמיום טטרוקסיד. לאחר דגירה אוסמיום טטרוקסיד, לטפל ברקמה עם 1%aqueous אורניל אצטט בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להמיס 0.066 גרם של חנקת עופרת ב 10 מיליליטר של 0.03 פתרון חומצה אספרטית טוחנת, ולהשתמש אחד הידרוקסיד אשלגן נורמלי כדי להתאים את ה- pH של פתרון אספרטט להוביל של וולטון ל 5.5.לאחר חימום הפתרון בתנור, לשטוף את הרקמה חמש פעמים במשך שלוש דקות לכל לשטוף בטמפרטורת החדר, מים מזוקקים כפול, לפני העברת הרקמה לתוך 60 מעלות צלזיוס חימם את פתרון אספרטט להוביל של וולטון במשך 30 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה לייבש אותו בסדרה עולה, קר כקרח אצטון, ואחריו דגירה של 10 דקות אצטון טמפרטורת החדר. לאחר מכן הניחו את הרקמה ביחס של 1:3 של שרף מעורב קשה באצטון במשך ארבע שעות של הסתננות על פלטפורמה מסתובבת, ואחריו חדירה של שמונה שעות או לילה ביחס של 1:1 של שרף לפתרון אצטון על פלטפורמה מסתובבת, ואז, חדירה לילה ביחס 3:1 של שרף לאצטון על הפלטפורמה המסתובבת.למחרת בבוקר, לחדור את הרקמה טרי 100% שף במשך ארבע עד שמונה שעות, לילה אחד, וחדירה אחת של ארבע שעות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה מסתובבת. למחרת בבוקר, להשתמש במקל עץ לערבב כמות קטנה של שרף עם אבקה שחורה פחמן עד שרף רווי עם האבקה, אבל הוא עדיין נוזל ולא הופך מגורען. המגורים צריכים להידמות דיו עבה, ולהיות מסוגל לאט לטפטף ללא גושים גלויים למקם את דגימת הרקמה בתבנית גומי סיליקון, וללכוד תמונה לעיון מאוחר יותר של כיוון המדגם בתוך בלוק הרזים.כאשר המדגם נמצא במקום, לכסות את הרקמה שרף רווי שחור פחמן בקצה עובש הסיליקון, עם התווית המציינת את פרטי הניסוי והרקמות בתבנית בקצה הנגדי של שרף. לאחר מכן, מניחים את התבנית לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס בשיפוע במשך כשעה. כאשר השרף חדורים שחור פחמן יש נרפא מספיק, להסיר את התבנית מהתנור, ומתחיל עם באר ריקה, למלא את שארית התבנית עם השרף ברור, דואג כי התווית נשארת גלויה.כאשר המדגם כבר מכוסה שרף ברור, מניחים את עובש הסיליקון בחזרה לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס, לא על שיפוע, במשך 48 שעות, ולאחר מכן להסיר את התבנית. כדי להכין את הבלוק להדמיה, הנח את הדגימה המוטבעת על צ'אק מיקרוטום עם הקצה המ מחודד דבק כחמישה עד שישה מילימטרים מתוך הצ'אק. נעל את הדגימה במקום עם בורג סט, והנח את הדגימה תחת מנורת חום.לאחר מספר דקות, הניחו את הצ'אק במחזיק מיקרוסקופ סטריאו, והשתמשו בסכין גילוח חדש בעל קצוות כפולים כדי ליצור חלקים דקים במקביל לפני הבלוק עד שהרקמה תהיה גלויה, שתהיה פחות רפלקטיבית וגרגרית בהשוואה לחלקי שרף נטולי רקמות. לאבטח סיכת דגימת אלומיניום במחזיק סיכת גיזום, ולעשות כמה עמוק, שריטות חוצה מול הסיכה כדי לספק שטח פנים גדול יותר עבור הדבק המשמש להחזיק את הדגימה במקום. מניחים את הדגימה תחת מנורת חום, ולדחוף את סכין הגילוח אחד עד שני מילימטרים ישר לתוך בלוק שף לפני ביצוע חתך שני, בניצב של עומק שווה לתוך הבלוק, כדי לקצץ את עודף שרסן מדגם הרקמה, כך הבלוק הוא כשלושה מילימטרים קוטר על ידי שניים עד שלושה מילימטרים בגובה.לאחר זמירה ראשונית זו, לחמם את הבלוק מתחת למנורה חום שוב, ולהשתמש חדש, סכין גילוח פיפיות כדי לחתוך את החלק העליון של בלוק שף בערך מילימטר אחד מתחת לחלק גזוז בחתך אחד, חלק. מניחים את מחזיק סיכת החיתוך, המכיל את סיכת האלומיניום החתוכה, בכלי הקיבול סטריאומיקרוסקופ, ומחילים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילאט על פני הסיכה כך שהוא מכסה לחלוטין את הסיכה מבלי ליצור מניסקוס גלוי. השתמש מלקחיים ללחוץ על חתיכת גזוז של בלוק רקמה על מרכז פני סיכת הדגימה במשך כמה שניות, ולאפשר את הדבק להגדיר במשך כמה דקות.כאשר הדבק התייבש ביסודיות, לאתר את הרקמה על החלק המוגבה של בלוק שף, ולהשתמש סכין גילוח פיפיות כדי לקצץ את החלק המוגבה של היצרן המכיל את דגימת הרקמה לאזור לא יותר ממילימטר מרובע אחד. לאט ובזהירות, להסיר כמו עודפי שריף ככל האפשר, משאיר את הבלוק קצת יותר בממד אחד, ולהשתמש בקובץ מתכת סופי כדי זווית עודף שריף באזור מחוץ לחלק המוגבה המכיל את דגימת הרקמה כלפי מטה לכיוון קצה הסיכה. הסר חלקיקי שף ואבק מהמדגם המוכן לפני החלת מעיל דק של צבע כסף זהב sputtering על פני השטח בלוק המדגם כולו.לאחר הציפוי, לקצץ כל צבע כסף עודף ממשטחי הפנים בלוק, ומניחים את הבלוק רכוב וקצוץ בקצה בולבוסי של צינור פיפטה העברה בהתאמה אישית עם התווית המתאימה המצורפת. באמצעות הדמיית SBF-SEM, זוהתה רשת של חבילות מיקרופיבריל נטולות אלסטין בתוך הקרנית של העכבר הבוגר. רשת זו מאורגנת בשכבות נפרדות, עם הסיבים הקשורים קשר הדוק עם keratocytes, אפילו שוכב בתוך invaginations רדוד על פני השטח keratocyte.יישום פרוטוקול זה הוביל לגילוי אוכלוסייה לא ידועה בעבר של עצבי קרנית מרכזיים המתמזגים עם תאי אפיתל בסיסיים בגבול הסטרומה-אפיתל. הדמיית SBF-SEM של הקרנית המרכזית חושפת את נוכחותם של כלי דם לימביים, חבילות עצבים ותאים נלווים שניתן לחלק באופן ידני לשחזור תלת-ממדי. כמה מכשולים של הליך הדמיה זה כוללים שימוש זמן שכן פיקסל ארוך מדי, אשר יכול לגרום לתמונות הבאות להיות גלי ומעוות, הפרשות קטנות של אלקטרונים מפני הבלוק, המוביל לשינויים ניגודיות מהירה בקווים, שריטות סכין על פני הבלוק עקב הצטברות סכין או פסולת פגומה על קצה הסכין חפצים מקרן אלקטרונים מורחבת מתמקדים בפני הבלוק בזמן שהמדגם עדיין בתא ההדמיה, קיבעון רקמות לא תקין, המוביל להפרדת מבנים תאיים ורקמת חיבור, ודילוג תמונה כתוצאה מכמות גדולה של טעינה בתוך בלוק הרקמה או השרף.בעת חיתוך בלוק הרקמה, חשוב להבין היטב היכן הרקמה נמצאת בתוך הבלוק, כדי לא לחתוך בטעות את כל אזורי המדגם החשובים. אם תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של מבנים סלולריים ספציפיים או אינטראקציות רצויות, ההדמיה יכולה להיעצר, הבלוק הוסר מהמיקרוסקופ, וחלקים לחתוך על ultramicrotome שבו הם יכולים להיות מוצגים במיקרוסקופ אלקטרונים שידור סידורי בלוק פנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר תצוגה ייחודית לחלוטין של רקמות ביולוגיות. באמצעות פרוטוקול זה, הצלחנו לרכוש במהירות ערכות נתונים איכותיות, ולהרחיב את מגוון הרקמות שאנו יכולים לחקור.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...