Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown e Margaret Gondo per la loro eccellente assistenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dai National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 e P30 EY007551 (National Eye Institute), in parte dalla Lion's Foundation for Sight, e in parte da NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development).

Tutti gli animali sono stati trattati secondo le linee guida descritte nella Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ofthalmology per l'uso degli animali nella ricerca sulla vista e sugli oftalmici e nelle linee guida per la manipolazione animale dell'University of Houston College of Optometry. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dalle istituzioni in cui sono state gestite: le procedure per topi, ratti, conigli, cavie e primati non umani sono state approvate dal Comitato per la cura ...

Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di evidenziare la metodologia di preparazione e imaging dei tessuti che ha permesso al nostro laboratorio di catturare in modo affidabile immagini di microscopia elettronica seriale ad alta risoluzione e di evidenziare i passaggi critici che portano a questo risultato e potenziali insidie che possono verificarsi durante la conduzione dell'imaging SBF-SEM. Il successo nell'utilizzo di questo protocollo richiede una corretta fissazione dei tessuti, l'impregnazione di metall...

La microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi seriali (SBF-SEM) è stata descritta per la prima volta da Leighton nel 1981, dove ha modellato un microscopio elettronico a scansione potenziato con un microtomo incorporato in grado di tagliare e tagliare sottili sezioni di tessuto incorporate nella resina. Sfortunatamente, le limitazioni tecniche ne limitavano l'uso a campioni conduttivi, poiché campioni non conduttivi come il tessuto biologico accumulavano livelli inaccettabili di carica (accumulo di elettroni all'interno del campione di tessuto)1. Mentre rivesteva il blocco-faccia tra i tagli con la ricarica dei tessuti ridotta al carbonio evaporato, questo aumentò notevolmente il tempo di acquisizione dell'imaging e la memorizzazione delle immagini rimase un problema poiché la tecnologia informatica all'epoca era insufficiente per gestire le grandi dimensioni dei file create dal dispositivo. Questa metodologia è stata rivisitata da Denk e Horstmann nel 2004 utilizzando uno SBF-SEM dotato di una camera a pressionevariabile 2. Ciò ha permesso l'introduzione del vapore acqueo nella camera di imaging che riduce la carica all'interno del campione, rendendo praticabile l'imaging di campioni non conduttivi anche se con una perdita di risoluzione dell'immagine. Ulteriori miglioramenti nella preparazione dei tessuti e nei metodi di imaging ora consentono l'imaging utilizzando un alto vuoto e l'imaging SBF-SEM non si basa più sul vapore acqueo per dissiparela carica 3,4,5,6,7,8,9. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell'uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging.
SBF-SEM consente la raccolta automatizzata di migliaia di immagini di microscopia elettronica registrate in serie, con risoluzione planare fino a 3-5 nm10,11. Il tessuto, impregnato di metalli pesanti e incorporato nella resina, è posto all'interno di un microscopio elettronico a scansione (SEM) contenente un ultramicrotoma dotato di coltello a diamante. Una superficie piana viene tagliata con il coltello a diamante, il coltello viene retratti e la superficie del blocco viene scansionata in un motivo raster con un fascio di elettroni per creare un'immagine di ultrastruttura tissutale. Il blocco viene quindi sollevato una quantità specificata (ad esempio, 100 nm) nell'asse Z, noto come "passo z", e una nuova superficie viene tagliata prima che il processo si ripeta. In questo modo viene prodotto un blocco di immagini tridimensionale (3D) man mano che il tessuto viene tagliato. Questo sistema di imaging beneficia ulteriormente della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno.
Mentre l'imaging SBF-SEM utilizza principalmente elettroni retroscatterati per formare un'immagine della faccia del blocco, gli elettroni secondari vengono generati durante il processo di imaging12. Gli elettroni secondari possono accumularsi, insieme agli elettroni retroscatterati e a fascio primario che non sfuggono al blocco, e produrre "carica tissutale", che può portare a un campo elettrostatico localizzato nella faccia del blocco. Questo accumulo di elettroni può distorcere l'immagine o causare l'espulsa di elettroni dal blocco e contribuire al segnale raccolto dal rivelatore backscatter, diminuendo il rapporto segnale-rumore13. Mentre il livello di carica tissutale può essere diminuito riducendo la tensione o l'intensità del fascio di elettroni o riducendo il tempo di divaggio del fascio, ciò si traduce in un rapporto segnale-rumoreridotto 14. Quando si utilizza un fascio di elettroni di tensione o intensità inferiore, o il fascio può abitare all'interno di ogni spazio di pixel solo per un periodo di tempo più breve, meno elettroni retroscatterati vengono espulsi dal tessuto e catturati dal rivelatore di elettroni con conseguente segnale più debole. Denk e Horstmann affrontavano questo problema introducendo vapore acqueo nella camera, riducendo così la carica nella camera e sulla faccia del blocco a costo della risoluzione dell'immagine. Con una pressione della camera di 10-100 Pa, una porzione del fascio di elettroni è sparsa contribuendo al rumore dell'immagine e alla perdita di risoluzione, tuttavia questo produce anche ioni nella camera del campione che neutralizza la carica all'interno del bloccocampione 2. Metodi più recenti per neutralizzare la carica all'interno del blocco campione utilizzano l'iniezione focale di gas di azoto sulla faccia del blocco durante l'imaging, o introducendo tensione negativa allo stadio SBF-SEM per ridurre l'energia di carico sonda-fascio e aumentare ilsegnale raccolto 6,7,15. Piuttosto che introdurre distorsioni dello stadio, pressione della camera o iniezione di azoto localizzata per ridurre l'accumulo di carica sulla superficie del blocco, è anche possibile aumentare la conducibilità della resina introducendo carbonio nella miscela di resina consentendo impostazioni di imaging più aggressive16. Il seguente protocollo generale è un adattamento del protocollo Deerinck et al. Mentre il protocollo precedentemente menzionato si concentrava sull'elaborazione dei tessuti e sull'impregnazione di metalli pesanti, questo protocollo fornisce informazioni sul flusso di lavoro di imaging, analisi dei dati e ricostruzione inerente agli studi SBF-SEM. Nel nostro laboratorio, questo protocollo è stato applicato con successo e riproducibile a un'ampia varietà di tessuti tra cui cornea e strutture del segmento anteriore, palpebra, ghiandola lacrimale e harderiana, retina e nervo ottico, cuore, polmone e vie aeree, rene, fegato, muscolo cremastere e corteccia cerebrale / midollo, e in una varietà di specie tra cui topo, ratto, coniglio, porcellino d'India, pesce, monostrato e colture cellulari stratificate, maiale, primate non umano,nonché umano 20,21,22,23. Sebbene piccoli cambiamenti possano essere utili per tessuti e applicazioni specifici, questo protocollo generale si è dimostrato altamente riproducibile e utile nel contesto della nostra struttura di imaging di base.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

La microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) consente la raccolta da centinaia a migliaia di immagini ultrastrutturali registrate in serie, offrendo una visione tridimensionale senza precedenti della microanatomia tissutale. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell'uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging. Questo sistema di imaging beneficia della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno. Tuttavia, senza un'adeguata preparazione dei tessuti, l'ultrastruttura cellulare può essere modificata in modo tale da poter trarre conclusioni errate o fuorvianti. Inoltre, le immagini vengono generate scansionando la faccia a blocchi di un campione biologico incorporato nella resina e questo spesso presenta sfide e considerazioni che devono essere affrontate. L'accumulo di elettroni all'interno del blocco durante l'imaging, noto come "carica tissutale", può portare a una perdita di contrasto e all'incapacità di apprezzare la struttura cellulare. Inoltre, mentre l'aumento dell'intensità/tensione del fascio di elettroni o la diminuzione della velocità di scansione del fascio possono aumentare la risoluzione dell'immagine, questo può anche avere lo sfortunato effetto collaterale di danneggiare il blocco di resina e distorcere le immagini successive nella serie di imaging. Qui presentiamo un protocollo di routine per la preparazione di campioni di tessuto biologico che preserva l'ultrastruttura cellulare e diminuisce la carica tissutale. Forniamo anche considerazioni di imaging per la rapida acquisizione di immagini seriali di alta qualità con danni minimi al blocco tissutale.

Cornea di topo Questo protocollo è stato ampiamente applicato alla cornea di topo. Utilizzando l'imaging SBF-SEM, è stata dimostrata la soddisfazione di una rete di fasci di microfibrille senza elastina (EF PCB) all'interno della cornea di topo adulta. In precedenza si credeva che questa rete fosse presente solo durante lo sviluppo embrionale e postnatale precoce. SBF-SEM ha rivelato una vasta rete EFMB in tutta la cornea, con fibre individuali che hanno un diametro di 100-200 nm se misurate in sezi...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Questo protocollo delinea un metodo di routine per l'utilizzo della microscopia elettronica seriale a scansione block-face (SBF-SEM), una potente tecnica di imaging 3D. L'applicazione di successo di SBF-SEM dipende da corrette tecniche di fissazione e colorazione dei tessuti, nonché da un'attenta considerazione delle impostazioni di imaging. Questo protocollo contiene considerazioni pratiche per l'intero processo.

Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

La microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi fornisce una visione senza precedenti delle ultra strutture tridimensionali dei tessuti e può rispondere a una serie di domande precedentemente impossibili o estremamente difficili da perseguire. Questa tecnica consente la produzione rapida e riproducibile di set di dati tridimensionali con carica e artefatti minimi dei tessuti. E, cosa importante, consente l'acquisizione automatica di migliaia di immagini al giorno.La microscopia elettronica a trasmissione standard fornisce un'eccellente ultra struttura cellulare. Tuttavia, queste immagini mancano di un contesto tridimensionale e possono essere difficili da interpretare. La microscopia elettronica seriale a scansione block-face fornisce quel contesto tridimensionale, consentendo l'interpretazione di processi complessi.Sebbene questo protocollo sia affidabile e riproducibile, alcuni passaggi richiedono precisione e sono di fondamentale importanza per il successo di questa metodologia. Questo video mostrerà questi passaggi critici in dettaglio. Dopo aver corretto campioni in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare, contenente il 2,5% di glutaraldeide e due cloruri di calcio millimolare, i campioni devono essere tagliati in blocchi non più grandi di due millimetri a cubetti e lavati con tampone di cacodilato di sodio molare contenente due cloruro di calcio millimolare.Il tessuto viene quindi colorato in sequenza con ferrocianuro di osmio, tiocarboidrazide e tetrossido di osmio. Dopo l'incubazione di tetrossido di osmio, trattare il tessuto con acetato di uranil acquoso all'1% a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, sciogliere 0,066 grammi di nitrato di piombo in 10 millilitri di soluzione di acido aspartico molare 0,03 e utilizzare un normale idrossido di potassio per regolare il pH della soluzione di aspartato di piombo del Walton a 5,5.Dopo aver riscaldato la soluzione nel forno, lavare il tessuto cinque volte per tre minuti per lavaggio a temperatura ambiente, acqua doppia distillata, prima di trasferire il tessuto in una soluzione di aspartato di piombo riscaldata di Walton di 60 gradi Celsius per 30 minuti a 60 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il tessuto e disidratarlo in una serie crescente di acetone ghiacciato, seguita da un'incubazione di 10 minuti nell'acetone a temperatura ambiente. Quindi posizionare il tessuto in un rapporto 1:3 di resina mista dura in acetone per quattro ore di infiltrazione su una piattaforma rotante, seguito da un'infiltrazione di otto ore o durante la notte in un rapporto 1:1 di resina a soluzione di acetone su una piattaforma rotante, quindi, un'infiltrazione notturna in un rapporto 3:1 di resina e acetone sulla piattaforma rotante.La mattina seguente, infiltrarsi nel tessuto in resina fresca al 100% per un'infiltrazione da quattro a otto ore, una durante la notte e un'infiltrazione di quattro ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. La mattina successiva, utilizzare un bastoncino di legno per mescolare una piccola quantità di resina con polvere nera fumo fino a quando la resina non è satura della polvere, ma è ancora fluida e non diventa granulosa. La residenza dovrebbe assomigliare all'inchiostro spesso ed essere in grado di gocciolare lentamente senza grumi visibili Posizionare il campione di tessuto in uno stampo di gomma siliconica e catturare un'immagine per un successivo riferimento dell'orientamento del campione all'interno del blocco di resina.Quando il campione è in posizione, coprire il tessuto nella resina satura nera fumo sulla punta dello stampo in silicone, con l'etichetta che indica i dettagli sperimentali e tissutali nello stampo all'estremità opposta della resina. Quindi, posizionare lo stampo in un forno a 65 gradi Celsius in pendenza per circa un'ora. Quando la resina infusa nero fumo si è polimerizzata a sufficienza, rimuovere lo stampo dal forno e, a partire da un pozzo vuoto, riempire il resto dello stampo con resina trasparente, facendo attenzione che l'etichetta rimanga visibile.Quando il campione è stato ricoperto di resina trasparente, riposizionare lo stampo in silicone nel forno a 65 gradi Celsius, non su una pendenza, per 48 ore, quindi rimuovere lo stampo. Per preparare il blocco per l'imaging, posizionare il campione incorporato nella resina su un mandrino microtomo con l'estremità affusolata che sporge da circa cinque a sei millimetri dal mandrino. Bloccare il campione in posizione con la vite impostata e posizionare il campione sotto una lampada termica.Dopo alcuni minuti, posizionare il mandrino in un supporto per microscopio stereo e utilizzare una nuova lama di rasoio a doppio taglio per rendere le sezioni sottili parallele alla faccia del blocco fino a quando il tessuto non è visibile, che sarà meno riflettente e granulare rispetto alle porzioni della resina prive di tessuto. Fissare un perno campione di alluminio nel portabigliere di rifilatura e fare diversi graffi profondi e incrociati nella faccia del perno per fornire una superficie più ampia per la colla utilizzata per tenere il campione in posizione. Posizionare il campione sotto una lampada termica e spingere il rasoio da uno a due millimetri direttamente nel blocco di resina prima di effettuare un secondo taglio perpendicolare di uguale profondità nel blocco, per tagliare via la resina in eccesso dal campione di tessuto in modo che il blocco sia di circa tre millimetri di diametro di due o tre millimetri di altezza.Dopo questo taglio iniziale, riscaldare nuovamente il blocco sotto la lampada termica e utilizzare una nuova lama di rasoio a doppio taglio per tagliare la parte superiore del blocco di resina circa un millimetro sotto la porzione tagliata in un unico taglio liscio. Posizionare il portabicca di rifilatura, contenente il perno di alluminio tagliato, nel contenitore stereomicroscopio e applicare un sottile strato di colla cianoacrilato sulla faccia del perno in modo che copra completamente il perno senza formare un menisco visibile. Utilizzare le pin per premere il pezzo di blocco di tessuto tagliato al centro del viso del perno del campione per diversi secondi e lasciare che la colla si prenoti per diversi minuti.Quando la colla si è accuratamente asciugata, individuare il tessuto sulla parte sollevata del blocco di resina e utilizzare un rasoio a doppio taglio per tagliare la porzione sollevata della resina contenente il campione di tessuto in un'area non superiore a un millimetro quadrato. Lentamente e con attenzione, rimuovere quanta più resina in eccesso possibile, lasciando il blocco leggermente più lungo in una dimensione, e utilizzare un file metallico finale per inclinare la resina in eccesso nell'area esterna alla porzione sollevata contenente il campione di tessuto verso il bordo del perno. Rimuovere le particelle di resina e la polvere dal campione preparato prima di applicare una sottile mano di vernice argentata e sputtering oro sull'intera superficie del blocco campione.Dopo il rivestimento, tagliare qualsiasi vernice argentata in eccesso dalle superfici del viso del blocco e posizionare il blocco montato e tagliato nell'estremità bulbosa di un tubo di pipetta di trasferimento su misura con l'etichetta appropriata attaccata. Utilizzando l'imaging SBF-SEM, è stata identificata una rete di fasci di microfibrille senza elastina all'interno della cornea di topo adulto. Questa rete è organizzata in strati distinti, con le fibre strettamente associate ai cheratociti, anche all'interno di invaginazioni poco profonde sulla superficie del cheratocita.L'applicazione di questo protocollo ha portato alla scoperta di una popolazione precedentemente sconosciuta di nervi corneali centrali che si fondono con cellule epiteliali basali al confine stromale-epiteliale. L'imaging SBF-SEM della cornea centrale rivela la presenza di vascucolatura limbale, fasci nervosi e cellule associate che possono essere segmentate manualmente per la ricostruzione 3D. Alcune insidie di questa procedura di imaging includono l'utilizzo di un tempo di divagazione dei pixel troppo lungo, che può causare immagini successive ondulate e distorte, piccole scariche di elettroni dalla faccia del blocco, portando a rapidi cambiamenti di contrasto nelle linee, graffi del coltello sulla faccia del blocco a causa di un coltello danneggiato o accumulo di detriti sul bordo del coltello , gli artefatti di un fascio di elettroni esteso si concentrano sulla faccia del blocco mentre il campione è ancora nella camera di imaging, fissazione impropria dei tessuti, che porta alla separazione delle strutture cellulari e del tessuto connettivo e salto dell'immagine a causa di una grande quantità di carica all'interno del tessuto o del blocco di resina.Quando si taglia il blocco tissutale, è importante avere una buona comprensione di dove si trova il tessuto all'interno del blocco, in modo da non tagliare accidentalmente le regioni campione importanti. Se si desidera immagini a risoluzione più elevata di specifiche strutture cellulari o interazioni, l'imaging può essere interrotto, il blocco rimosso dal microscopio e le sezioni tagliate su un ultramicrotomo in cui possono essere visualizzate in un microscopio elettronico a trasmissione Microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi consente una visione del tutto unica dei tessuti biologici. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di acquisire rapidamente set di dati di qualità e di espandere la gamma di tessuti che possiamo esplorare.

Research

JoVE Journal

Biology

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