Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
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サム・ハンロン博士、エブリン・ブラウン博士、マーガレット・ゴンド博士の優れた技術支援に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)R01 EY-018239およびP30 EY007551(国立眼科研究所)の一部、一部はライオン視覚財団、一部はNIH 1R15 HD084262-01(国立小児保健人間開発研究所)によって支えられました。

すべての動物は、視力および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究の研究声明およびヒューストン大学検眼動物取り扱いガイドラインに記載されているガイドラインに従って取り扱われました。すべての動物の手順は、彼らが取り扱われた機関によって承認されました:マウス、ラット、ウサギ、モルモット、および非ヒト霊長類の手順はヒューストン大学動物ケアと使用...

この方法論文の目的は、当社の研究室が高解像度のシリアル電子顕微鏡画像を確実にキャプチャすることを可能にした組織調製法とイメージング方法論を強調し、この結果につながる重要なステップと、SBF-SEMイメージングを行う際に起こり得る潜在的な落とし穴を指摘することです。このプロトコルを使用して成功するには、組織の適切な固定、サンプルへの重金属の含浸、充填樹脂の改質...

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、1981年にレイトンによって最初に説明され、樹脂に埋め込まれた組織の薄い部分を切断して画像化できる内蔵のミクロトームで増強された走査型電子顕微鏡を作りました。残念ながら、技術的な制限は、生体組織などの非導電性サンプルが許容できないレベルの充電(組織サンプル内の電子蓄積)を蓄積したように、その使用を導電性試料に制限した。蒸発した炭素減らされたティッシュの充満で切り傷の間のブロック面をコーティングする間、この画像取得時間およびイメージ貯蔵は、当時のコンピュータ技術が装置によって作成された大きなファイルサイズを管理するのに不十分であったため、問題が残った。この方法論は、可変圧室2を搭載したSBF-SEMを用いて、2004年にデンクとホルストマンによって再検討された。これにより、サンプル内の充電を低減するイメージングチャンバに水蒸気を導入することができ、非導電性サンプルのイメージングは、画像解像度の損失とはいえ実行可能になります。組織調製法およびイメージング法のさらなる改善により、高真空を用いたイメージングが可能となり、SBF-SEMイメージングは、もはや、充電3、4、5、6、7、8、9を放散するために水蒸気に依存しなくなりました。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。
SBF-SEMは、3-5 nm10、11の小さな平面解像度で、何千もの連続登録電子顕微鏡画像の自動収集を可能にします。重金属を含浸させ、樹脂に埋め込まれた組織は、ダイヤモンドナイフを取り付けた超ミクロトームを含む走査型電子顕微鏡(SEM)内に配置される。平らな表面をダイヤモンドナイフで切断し、ナイフを引き込み、ブロックの表面を電子ビームでラスターパターンでスキャンして組織の超構造の画像を作成します。次に、ブロックは「z ステップ」と呼ばれる z 軸で指定された量 (例えば 100 nm) を上げ、プロセスが繰り返される前に新しいサーフェスがカットされます。このようにして、組織が切り取られると、画像の3次元(3D)ブロックが生成されます。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質からさらに恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。
SBF-SEMイメージングは主にブロック面の画像を形成するために後方散乱電子を使用するが、二次電子は、撮像プロセス12の間に生成される。二次電子は、ブロックから逃げない後方散乱型電子や一次ビーム電子と並んで蓄積し、ブロック面に局在する静電場につながる「組織充電」を生み出す。この電子蓄積は、画像を歪めたり、ブロックから放出される電子を発生させ、後方散乱検出器によって集められた信号に寄与し、信号対雑音比13を減少させる。組織の帯電のレベルは、電子線の電圧または強度を低減させることによって減少させることができるが、またはビームのドウェル時間を短縮するが、これは減少する信号対雑音比14をもたらす。低電圧または強度の電子ビームを使用する場合、またはビームが各ピクセル空間内に短期間だけ収まる場合、組織から放出される後方散乱電子が少なく、より弱い信号をもたらす電子検出器によって捕捉される。デンクとホルストマンは、チャンバーに水蒸気を導入することによってこの問題に対処し、それによって画像解像度を犠牲にしてチャンバーとブロック面の電荷を低減した。チャンバー圧力が10-100 Paの場合、電子ビームの一部が散乱して画像ノイズや分解能の損失を起こしますが、試料室ではイオンが生成され、サンプルブロック2内の電荷が中和します。サンプルブロック内の電荷を中和する方法は、撮像中にブロック面上に窒素の焦点ガス注入を使用する、またはプローブビーム集荷エネルギーを減少させ、6、7、15を集めた信号を増加させるためにSBF-SEM段階に負の電圧を導入する。ステージバイアスを導入するのではなく、チャンバー圧力や局在窒素注入をブロック表面への電荷蓄積を低減させ、より積極的な撮像設定16を可能にする樹脂ミックスにカーボンを導入することにより樹脂の導電率を高めることも可能である。以下の一般的なプロトコルは、2010年に発表されたDeerinckら.プロトコルの適応であり、高分解能画像取得3、17、18、19を維持しながら組織の充電を最小限に抑えるために有用であるとわかった組織準備およびイメージング方法論の変更をカバーしている。前述のプロトコルは組織処理と重金属含浸に焦点を当てていますが、このプロトコルはSBF-SEM研究に固有のイメージング、データ分析、および再構築ワークフローに関する洞察を提供します。当研究室では、このプロトコルは、角膜や前部構造を含む多種多様な組織にうまく、再現的に適用されています。 まぶた、涙液および硬直腺、失明および視神経、心臓、肺および気道、腎臓、肝臓、クレマスター筋肉、および大脳皮質/髄質、およびマウス、ラット、ウサギ、モルモット、魚、単層および層状細胞培養、豚、非ヒト霊長類、ヒト20、22、23小さな変更は特定の組織やアプリケーションにとって価値があるかもしれませんが、この一般的なプロトコルは、当社のコアイメージング機能のコンテキストで非常に再現性と有用性が証明されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、数百から数千の連続登録された超構造画像の収集を可能にし、組織微小解剖学の前例のない3次元ビューを提供します。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質から恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。しかし、適切な組織製剤がなければ、細胞の超構造は、誤った結論や誤解を招く結論が導かれるような方法で変更することができます。さらに、画像は、樹脂組み込み生物学的サンプルのブロック面をスキャンすることによって生成され、これはしばしば対処しなければならない課題と考慮事項を提示します。「組織充電」と呼ばれるイメージング中のブロック内の電子の蓄積は、コントラストの喪失と細胞構造を理解できないことにつながる可能性があります。さらに、電子ビームの強度/電圧を上げたり、ビームスキャン速度を下げたりすると画像解像度が向上しますが、これはまた、樹脂ブロックを損傷し、イメージングシリーズの後続の画像を歪めるという不幸な副作用を持つことができます。ここでは、細胞の超構造を維持し、組織の充電を減少させる生体組織サンプルの調製のためのルーチンプロトコルを提示する。また、組織ブロックへのダメージを最小限に抑えた高品質のシリアル画像の迅速な取得に関する画像化に関する考慮事項も提供しています。

マウスコルネア このプロトコルは、マウス角膜に広く適用されています。SBF-SEMイメージングを用いて、エラスチンフリーマイクロフィブリル束(EFMB)のネットワークが成体マウス角膜内に存在することが示された。以前は、このネットワークは胚性および出生後早期の発達中にのみ存在すると考えられていました。SBF-SEMは角膜全体に広範なEFMBネットワークを明らかにし、断面?...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

このプロトコルは、強力な3Dイメージング技術であるシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)を使用するための日常的な方法を概説しています。SBF-SEMヒンジの適用に成功し、適切な固定および組織染色技術に加え、イメージング設定を慎重に検討します。このプロトコルには、このプロセス全体に対する実用的な考慮事項が含まれています。

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡は、3次元組織の超構造の前例のないビューを提供し、これまで不可能または追求することが非常に困難な質問のホストに答えることができます。この技術により、組織の充電とアーティファクトを最小限に抑え、3次元データセットを迅速かつ再現可能に生産できます。そして重要なのは、毎日何千もの画像を自動的にキャプチャできることです。標準透過電子顕微鏡は、優れた細胞超構造を提供します。しかし、これらの画像は3次元の文脈を欠いているし、解釈するのが難しい場合がある。シリアルブロック面走査電子顕微鏡は、複雑なプロセスの解釈を可能にする、その三次元的な文脈を提供する。このプロトコルは信頼性が高く再現可能ですが、特定の手順では精度が必要であり、この方法論を成功させるためには非常に重要です。このビデオでは、これらの重要な手順を詳しく説明します。サンプルを0.1モルカコチル化ナトリウムに固定し、2.5%グルタルアルデヒドと2ミリモル塩化カルシウムを含み、試料を2ミリメートル以下のブロックに切断し、2ミリモル塩化カルシウムを含む0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液で洗浄する必要があります。その後、オスミウムフェロシアン化物、チオカルボヒドラジド、および四酸化オスミウムで組織を順次染色する。四酸化オスミウムインキュベーション後、一晩摂氏4度で1%酢酸尿水酢酸の組織を治療する。翌朝、0.066グラムの硝酸鉛を0.03モルアスパラギン酸溶液の10ミリリットルに溶解し、通常の水酸化カリウム1個を使用してウォルトンの鉛アスパラギン酸溶液のpHを5.5に調整する。オーブンで溶液を温めた後、室温、二重蒸留水で洗浄ごとに3分間組織を5回洗浄し、組織を摂氏60度に移し、ウォルトンの鉛アスパルタン溶液を摂氏60度で30分間温めます。インキュベーションの終わりに、組織を洗浄し、上昇した氷冷アセトンシリーズで脱水し、続いて室温アセトンで10分間のインキュベーションを行います。次いで、回転プラットフォーム上で4時間のアセトン中の硬混合樹脂の1:3比に組織を配置し、回転プラットフォーム上の樹脂とアセトン溶液の1:1比で8時間または一晩浸潤し、回転プラットフォーム上の樹脂とアセトンの3:1比で一晩浸潤する。翌朝、回転プラットフォーム上の室温で1つの4〜8時間、1泊1回、および1つの4時間の浸潤のために新鮮な100%樹脂で組織を浸透させる。翌朝、少量の樹脂とカーボンブラックパウダーを混合して、樹脂が粉末で飽和するまで、木製スティックを使用しますが、まだ流動性が高く、粒状になることはありません。住居は厚いインクに似ており、目に見える塊なしでゆっくりと滴下することができ、シリコーンゴム型に組織サンプルを置き、後で樹脂ブロック内のサンプル配向を参照するための画像をキャプチャします。試料が所定の位置にある場合、シリコーンモールドの先端にあるカーボンブラック飽和樹脂に組織を覆い、そのラベルは、樹脂の反対側端にある鋳型における実験および組織の詳細を示す。その後、約1時間の傾斜で65°Cのオーブンに金型を置きます。カーボンブラック注入樹脂が十分に硬化したら、オーブンから金型を取り出し、空の井戸から始め、残りの金型を透明な樹脂で満たし、ラベルが目に見えるままにしてください。サンプルが透明な樹脂で覆われたら、シリコーンモールドを傾斜ではなく65°Cのオーブンに48時間戻し、金型を取り外します。イメージング用のブロックを準備するには、樹脂埋め込み標本をマイクロトームチャックに置き、テーパーエンドがチャックから約5〜6ミリメートルを突き出します。セットネジで試料を所定の位置にロックし、試料をヒートランプの下に置きます。数分後、チャックをステレオ顕微鏡ホルダーに入れ、新しい両刃のカミソリブレードを使用して、組織が見えるまで薄い切片をブロック面に平行にします。トリミングピンホルダーにアルミニウム製の試料ピンを固定し、ピンの面にいくつかの深い十字架の傷を作り、試料を所定の位置に保持するために使用される接着剤のためのより大きな表面積を提供します。試料をヒートランプの下に置き、カミソリを樹脂ブロックに1〜2ミリメートルまっすぐに押し込んでから、ブロックに等しい深さの垂直なカットを行い、ブロックの直径が約3ミリメートル高くなるようにティッシュサンプルから余分な樹脂をトリミングします。この最初のトリミングの後、再びヒートランプの下にブロックを温め、新しい両刃のカミソリブレードを使用して、1つの滑らかなカットでトリミングされた部分の約1ミリメートル下の樹脂ブロックの上部を切断します。切断したアルミニウムピンを含むトリミングピンホルダーを実体顕微鏡のレセプタクルに入れ、シアノアクリル酸接着剤の薄い層をピン面に塗布し、目に見える半月板を形成することなくピンを完全に覆います。鉗子を使用して、トリミングされた組織ブロックを標本ピン面の中央に数秒間押し付け、接着剤を数分間セットします。接着剤が十分に乾燥したら、樹脂ブロックの隆起部分に組織を配置し、両刃のカミソリを使用して、組織サンプルを含む樹脂の隆起部分を1平方ミリメートル以下の領域にトリミングします。ゆっくりと慎重に、できるだけ多くの余分な樹脂を取り除き、ブロックを1次元に少し長く残し、最終的な金属ファイルを使用して、組織サンプルを含む隆起部分の外側の領域の余分な樹脂をピンの端に向かって下に傾けます。サンプルブロック表面全体に銀色塗料と金スパッタリングの薄いコートを塗布する前に、準備されたサンプルから樹脂の粒子とほこりを取り除きます。コーティング後、ブロック面の表面から余分な銀色の塗料をトリミングし、取り付けられたトリミングされたブロックを、適切なラベルが付いたカスタムメイドの転写ピペットチューブの球根端に置きます。SBF-SEMイメージングを用いて、成人マウス角膜内でエラスチンフリーマイクロフィブリル束のネットワークが同定されている。このネットワークは、角膜細胞表面の浅い内層に横たわっている繊維が、角膜細胞と密接に関連付けられている、別個の層で組織されています。このプロトコルの適用は、間質上皮の境界で基底上皮細胞と融合する中央角膜神経の未知の集団の発見につながっている。中央角膜のSBF-SEMイメージングは、3D再構成のために手動でセグメント化することができる四肢血管系、神経束および関連細胞の存在を明らかにする。このイメージング手順のいくつかの落とし穴には、あまりにも長いピクセル滞量時間を使用することが含まれており、その後の画像が波状に歪み、ブロック面からの電子の小さな放電、ラインの急速なコントラスト変化、ナイフの損傷によるブロック面のナイフの傷、ナイフの端に蓄積された破片によるブロック面の傷につながる可能性があります、サンプルがまだイメージングチャンバーにある間にブロック面に焦点を当てた拡張電子ビームからのアーチは、不適切な組織固定、細胞構造と結合組織の分離、および組織または樹脂ブロック内で大量の充電の結果として画像スキップを導く。組織ブロックを切断する際には、組織がブロック内のどこにあるかをよく理解することが重要であり、重要なサンプル領域を誤ってトリミングしないようにする。特定の細胞構造または相互作用のより高い解像度の画像が望ましい場合、イメージングを停止し、ブロックを顕微鏡から取り除き、透過電子顕微鏡で見ることができる超ミクロトーム上の切片を切断することができます。このプロトコルを使用して、我々は迅速に品質データセットを取得し、我々は探求できる組織の範囲を拡大することができました。

Research

JoVE Journal

Biology

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