Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
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Nos gustaría agradecer al Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown y Margaret Gondo por su excelente asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) R01 EY-018239 y P30 EY007551 (Instituto Nacional del Ojo), en parte por la Fundación del León para la Vista, y en parte por nih 1R15 HD084262-01 (Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano).

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las pautas descritas en la Declaración de manejo de animales para el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica de la Universidad de Houston y la Facultad de Optometría de la Universidad de Houston. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por las instituciones en las que se manejaron: los procedimientos de ratón, rata, conejo, conejillo de Indias y primates no humanos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Un...

El propósito de este papel de los métodos es destacar la preparación del tejido y la metodología de la proyección de imagen que ha permitido que nuestro laboratorio capture confiablemente imágenes seriales de alta resolución de la microscopia electrónica, y señalar los pasos críticos que llevan a este resultado así como las trampas potenciales que pueden ocurrir al conducir proyección de imagen de SBF-SEM. El éxito en el uso de este protocolo requiere la fijación adecuada del tejido, la impregnación de met...

La microscopía electrónica de barrido facial de bloques en serie (SBF-SEM) fue descrita por primera vez por Leighton en 1981, donde creó un microscopio electrónico de barrido aumentado con un microtomo incorporado que podía cortar e imaginar secciones delgadas de tejido incrustadas en resina. Desafortunadamente, las limitaciones técnicas restringieron su uso a muestras conductoras, ya que las muestras no conductoras, como el tejido biológico, acumularon niveles inaceptables de carga (acumulación de electrones dentro de la muestra de tejido)1. Si bien el recubrimiento de la cara de bloque entre cortes con carbono evaporado redujo la carga de tejido, esto aumentó en gran medida el tiempo de adquisición de imágenes y el almacenamiento de imágenes siguió siendo un problema, ya que la tecnología informática en ese momento era insuficiente para administrar los grandes tamaños de archivo creados por el dispositivo. Esta metodología fue revisada por Denk y Horstmann en 2004 utilizando un SBF-SEM equipado con una cámara de presión variable2. Esto permitió la introducción de vapor de agua a la cámara de imágenes, lo que reduce la carga dentro de la muestra, haciendo que las imágenes de muestras no conductoras sean viables, aunque con una pérdida de resolución de imagen. Las mejoras adicionales en la preparación del tejido y los métodos de la proyección de imagen ahora permiten la proyección de imagen usando el alto vacío, y la proyección de imagen de SBF-SEM confía no más en el vapor de agua para disipar la carga3,4,5,6,7,8,9. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen.
SBF-SEM permite la recolección automatizada de miles de imágenes de microscopía electrónica registradas en serie, con una resolución plana tan pequeña como 3-5 nm10,11. El tejido, impregnado con metales pesados e incrustado en resina, se coloca dentro de un microscopio electrónico de barrido (SEM) que contiene un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de diamante. Una superficie plana se corta con el cuchillo de diamante, el cuchillo se retrae y la superficie del bloque se escanea en un patrón ráster con un haz de electrones para crear una imagen de ultraestructura de tejido. A continuación, el bloque se eleva una cantidad especificada (por ejemplo, 100 nm) en el eje z, conocido como "paso z", y se corta una nueva superficie antes de que se repita el proceso. De esta manera se produce un bloque de imágenes de 3 dimensiones (3D) a medida que se corta el tejido. Este sistema de imágenes se beneficia aún más de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día.
Mientras que las imágenes SBF-SEM utilizan principalmente electrones retrosperdicionados para formar una imagen de la cara de bloque, los electrones secundarios se generan durante el proceso de obtención de imágenes12. Los electrones secundarios pueden acumularse, junto con los electrones retrospersión y de haz primario que no escapan del bloque, y producen "carga de tejido", lo que puede conducir a un campo electrostático localizado en la cara del bloque. Esta acumulación de electrones puede distorsionar la imagen o hacer que los electrones sean expulsados del bloque y contribuir a la señal recogida por el detector de retrospersión, disminuyendo la relación señal/ruido13. Mientras que el nivel de carga del tejido puede disminuirse reduciendo el voltaje o la intensidad del haz de electrones, o reduciendo el tiempo de permanencia del haz, esto resulta en una relación señal/ruido disminuida14. Cuando se utiliza un haz de electrones de menor voltaje o intensidad, o el haz solo puede habitar dentro de cada espacio de píxeles durante un período de tiempo más corto, menos electrones retrodispersión son expulsados del tejido y capturados por el detector de electrones, lo que resulta en una señal más débil. Denk y Horstmann abordaron este problema introduciendo vapor de agua en la cámara, reduciendo así la carga en la cámara y en la cara del bloque a costa de la resolución de la imagen. Con una presión de cámara de 10-100 Pa, una parte del haz de electrones se dispersa contribuyendo al ruido de la imagen y una pérdida de resolución, sin embargo, esto también produce iones en la cámara de la muestra que neutraliza la carga dentro del bloque de muestra2. Los métodos más recientes para neutralizar la carga dentro del bloque de muestra utilizan la inyección focal de gas de nitrógeno sobre la cara del bloque durante la toma de imágenes, o la introducción de voltaje negativo en la etapa SBF-SEM para disminuir la energía de la sonda-haz-lading y aumentar la señal recogida6,7,15. En lugar de introducir sesgo de etapa, presión de cámara o inyección localizada de nitrógeno para disminuir la acumulación de carga en la superficie del bloque, también es posible aumentar la conductividad de la resina mediante la introducción de carbono en la mezcla de resina, lo que permite ajustes de imagen más agresivos16. El siguiente protocolo general es una adaptación del protocolo de Deerinck et al. publicado en 2010 y cubre las modificaciones en la preparación de tejidos y las metodologías de imagen que encontramos útiles para minimizar la carga de tejidos mientras se mantiene la adquisición de imágenes de alta resolución3,17,18,19. Mientras que el protocolo previamente mencionado se centró en el proceso del tejido y la impregnación del metal pesado, este protocolo proporciona la penetración en la proyección de imagen, el análisis de datos, y el flujo de trabajo de la reconstrucción inherentes a los estudios de SBF-SEM. En nuestro laboratorio, este protocolo se ha aplicado con éxito y reproduciblemente a una amplia variedad de tejidos, incluyendo córnea y estructuras del segmento anterior, párpado, glándula lagrimal y harderiana, retina y nervio óptico, corazón, pulmón y vía aérea, riñón, hígado, músculo cremaster y corteza cerebral / médula, y en una variedad de especies que incluyen ratón, rata, conejo, conejillo de Indias, peces, monocapa y cultivos celulares estratificados, cerdo, primate no humano, así como humanos20,21,22,23. Mientras que los pequeños cambios pueden valer la pena para tejidos y aplicaciones específicos, este protocolo general ha demostrado ser altamente reproducible y útil en el contexto de nuestra instalación de imágenes principales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

La microscopia electrónica serial de la bloque-cara de la exploración (SBF-SEM) permite la colección de centenares a millares de imágenes ultraestructurales en serie-registradas, ofreciendo una vista tridimensional sin precedentes del tejido microanatomy. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen. Este sistema de imágenes se beneficia de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día. Sin embargo, sin la preparación apropiada del tejido la ultraestructura celular se puede alterar de una manera tal que las conclusiones incorrectas o engañosas pudieran ser dibujadas. Además, las imágenes se generan escaneando la cara de bloque de una muestra biológica incrustada en resina y esto a menudo presenta desafíos y consideraciones que deben abordarse. La acumulación de electrones dentro del bloque durante la proyección de imagen, conocida como "carga del tejido," puede llevar a una pérdida de contraste y a una inhabilidad de apreciar la estructura celular. Además, si bien el aumento de la intensidad/voltaje del haz de electrones o la disminución de la velocidad de escaneo del haz pueden aumentar la resolución de la imagen, esto también puede tener el desafortunado efecto secundario de dañar el bloque de resina y distorsionar las imágenes posteriores en la serie de imágenes. Aquí presentamos un protocolo de rutina para la preparación de muestras de tejido biológico que preserva la ultraestructura celular y disminuye la carga tisular. También proporcionamos las consideraciones de la proyección de imagen para la adquisición rápida de serial-imágenes de alta calidad con daño mínimo al bloque del tejido.

Córnea del ratón Este protocolo se ha aplicado extensivamente a la córnea del ratón. Usando proyección de imagen de SBF-SEM una red de paquetes elastino-libres de la microfibrrilla (EFMBs) fue mostrado para estar presente dentro de la córnea adulta del ratón. Se creía previamente que esta red sólo estaba presente durante el desarrollo embrionario y postnatal temprano. SBF-SEM reveló una extensa red EFMB en toda la córnea, con fibras individuales encontradas para ser 100-200 nanómetro de di...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Este protocolo delinea un método rutinario para usar la microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara (SBF-SEM), una técnica de proyección de imagen 3D potente. El uso acertado de SBF-SEM depende de técnicas apropiadas de la fijación y de la coloración del tejido, así como de la consideración cuidadosa de los ajustes de la proyección de imagen. Este protocolo contiene consideraciones prácticas para la totalidad de este proceso.

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

La microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara proporciona una visión sin precedentes de las estructuras ultra tridimensionales del tejido, y puede contestar a un anfitrión de preguntas previamente imposibles o excesivamente difíciles de perseguir. Esta técnica permite la producción rápida y reproducible de conjuntos de datos tridimensionales con una carga y artefactos de tejido mínimos. Y lo que es más importante, permite la captura automatizada de miles de imágenes diariamente.La microscopia electrónica de transmisión estándar proporciona una excelente ultraestructura celular. Sin embargo, estas imágenes carecen de contexto tridimensional y pueden ser difíciles de interpretar. La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie proporciona ese contexto tridimensional, lo que permite la interpretación de procesos complejos.Si bien este protocolo es confiable y reproducible, ciertos pasos requieren precisión y son de importancia crítica para el éxito de esta metodología. Este vídeo mostrará estos pasos críticos en detalle. Después de fijar las muestras en tampón de cacodilato de sodio molar, que contiene 2,5% de glutaraldehído, y dos cloruros de calcio milimolares, las muestras deben cortarse en bloques no mayores de dos milímetros en cubos y lavarse con un tampón de cacodilato de sodio molar que contenga dos cloruros de calcio milimolares.El tejido se tiñe secuencialmente con ferrocianuro de osmio, tiocarbohidrazida y tetróxido de osmio. Después de la incubación del tetróxido de osmio, trate el tejido con acetato de uranilo acuoso al 1% a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, disuelva 0.066 gramos de nitrato de plomo en 10 mililitros de solución de ácido aspártico molar, y use un hidróxido de potasio normal para ajustar el pH de la solución de aspartato de plomo de Walton a 5.5.Después de calentar la solución en el horno, lave el tejido cinco veces durante tres minutos por lavado a temperatura ambiente, agua doble destilada, antes de transferir el tejido a una solución de aspartato de plomo de Walton calentada a 60 grados Celsius durante 30 minutos a 60 grados Celsius. Al final de la incubación, lave el tejido y deshidrate en una serie ascendente de acetona helada, seguida de una incubación de 10 minutos en acetona a temperatura ambiente. Luego coloque el tejido en una proporción de 1:3 de resina mezclada duramente en acetona durante cuatro horas de infiltración en una plataforma giratoria, seguida de una infiltración de ocho horas o durante la noche en una proporción de 1:1 de resina a solución de acetona en una plataforma giratoria, luego, una infiltración nocturna en una proporción de 3:1 de resina a acetona en la plataforma giratoria.A la mañana siguiente, infiltre el tejido en resina fresca al 100% durante una infiltración de cuatro a ocho horas, una durante la noche y una de cuatro horas a temperatura ambiente en una plataforma giratoria. A la mañana siguiente, use un palo de madera para mezclar una pequeña cantidad de resina con polvo negro de carbono hasta que la resina esté saturada con el polvo, pero todavía es fluida y no se vuelve granulada. La residencia debe parecerse a la tinta gruesa, y ser capaz de gotear lentamente sin grupos visibles Coloque la muestra de tejido en un molde de caucho de silicona, y capturar una imagen para referencia posterior de la orientación de la muestra dentro del bloque de resina.Cuando la muestra esté en su lugar, cubra el tejido en la resina saturada de negro de carbón en la punta del molde de silicona, con la etiqueta que indica los detalles experimentales y de tejido en el molde en el extremo opuesto de la resina. Luego, coloque el molde en un horno de 65 grados Celsius en una pendiente durante aproximadamente una hora. Cuando la resina infundida de negro de carbón se haya curado lo suficiente, retire el molde del horno, y comenzando con un pozo vacío, llene el resto del molde con resina transparente, teniendo cuidado de que la etiqueta permanezca visible.Cuando la muestra se haya cubierto con resina transparente, coloque el molde de silicona de nuevo en el horno de 65 grados Celsius, no en una pendiente, durante 48 horas, luego retire el molde. Para preparar el bloque para la toma de imágenes, coloque la muestra incrustada en resina en un mandril de microtoma con el extremo cónico pegando aproximadamente de cinco a seis milímetros fuera del mandril. Bloquee la muestra en su lugar con el tornillo de ajuste y colóque la muestra debajo de una lámpara de calor.Después de varios minutos, coloque el mandril en un soporte de microscopio estéreo y use una nueva cuchilla de afeitar de doble filo para hacer secciones delgadas paralelas a la cara del bloque hasta que el tejido sea visible, lo que será menos reflectante y granular en comparación con las porciones de la resina que están desprovistas de tejido. Asegure un pasador de espécimen de aluminio en el soporte del pasador de recorte y haga varios arañazos profundos y entrecruzados en la cara del pasador para proporcionar una mayor superficie para el pegamento utilizado para mantener la muestra en su lugar. Coloque la muestra debajo de una lámpara de calor y empuje la maquinilla de afeitar de uno a dos milímetros directamente hacia abajo en el bloque de resina antes de hacer un segundo corte perpendicular de igual profundidad en el bloque, para recortar el exceso de resina de la muestra de tejido para que el bloque sea de aproximadamente tres milímetros de diámetro por dos a tres milímetros de altura.Después de este recorte inicial, caliente el bloque debajo de la lámpara de calor de nuevo y use una nueva cuchilla de afeitar de doble filo para cortar la parte superior del bloque de resina aproximadamente un milímetro por debajo de la porción recortada en un solo corte suave. Coloque el soporte del pasador de recorte, que contiene el pasador de aluminio cortado, en el receptáculo del estereomicroscopio, y aplique una capa delgada de pegamento de cianocrilato a la cara del pasador de modo que cubra completamente el pasador sin formar un menisco visible. Use fórceps para presionar la pieza recortada de bloque de tejido en el centro de la cara del pasador de la muestra durante varios segundos y permita que el pegamento se ajuste durante varios minutos.Cuando el pegamento se haya secado a fondo, localice el tejido en la porción elevada del bloque de resina y use una maquinilla de afeitar de doble filo para recortar la porción elevada de la resina que contiene la muestra de tejido a un área no mayor de un milímetro cuadrado. Lenta y cuidadosamente, retire la mayor cantidad posible de exceso de resina, dejando el bloque un poco más largo en una dimensión, y use un archivo de metal final para inclinar el exceso de resina en el área fuera de la porción elevada que contiene la muestra de tejido hacia abajo hacia el borde del pasador. Retire las partículas de resina y el polvo de la muestra preparada antes de aplicar una capa delgada de pintura de plata y pulverización de oro a toda la superficie del bloque de muestra.Después del recubrimiento, recorte cualquier exceso de pintura plateada de las superficies de la cara del bloque y coloque el bloque montado y recortado en el extremo bulboso de un tubo de pipeta de transferencia hecho a medida con la etiqueta apropiada adjunta. Usando proyección de imagen de SBF-SEM, una red de paquetes elastino-libres de la microfibrrilla se ha identificado dentro de la córnea adulta del ratón. Esta red se organiza en capas distintas, con las fibras estrechamente asociadas con los queratocitos, incluso dentro de invaginaciones poco profundas en la superficie del queratocitos.El uso de este protocolo ha llevado al descubrimiento de una población previamente desconocida de los nervios córneos centrales que se fundan con las células epiteliales básicas en la frontera stromal-epitelial. La proyección de imagen de SBF-SEM de la córnea central revela la presencia de vasculatura limbal, de paquetes del nervio, y de células asociadas que se puedan segmentar manualmente para la reconstrucción 3D. Algunas trampas de este procedimiento de imágenes incluyen el uso de un tiempo de permanencia de píxeles demasiado largo, que puede causar que las imágenes posteriores sean onduladas y distorsionadas, pequeñas descargas de electrones de la cara del bloque, lo que lleva a cambios rápidos en el contraste en las líneas, arañazos de cuchillo en la cara del bloque debido a un cuchillo dañado o acumulación de escombros en el borde del cuchillo , artefactos de un haz de electrones extendido se centran en la cara del bloque mientras la muestra todavía está en la cámara de imágenes, fijación inadecuada del tejido, lo que lleva a la separación de las estructuras celulares y el tejido conectivo, y la pérdida de imagen como resultado de una gran cantidad de carga dentro del bloque de tejido o resina.Al cortar el bloque de tejido, es importante tener una buena comprensión de dónde se encuentra el tejido dentro del bloque, Con el fin de no recortar accidentalmente las regiones importantes de la muestra. Si se desean imágenes de mayor resolución de estructuras o interacciones celulares específicas, se puede detener la obtención de imágenes, eliminar el bloqueo del microscopio y cortar secciones en un ultramicrotome donde se pueden ver en un microscopio electrónico de transmisión La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie permite una vista totalmente única de los tejidos biológicos. Usando este protocolo, hemos podido adquirir rápidamente conjuntos de datos de calidad y ampliar la gama de tejidos que podemos explorar.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Investigación

Biología

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

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Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

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Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

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