Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown ve Margaret Gondo'ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 EY-018239 ve P30 EY007551 (Ulusal Göz Enstitüsü), kısmen Lion's Foundation for Sight ve kısmen NIH 1R15 HD084262-01 (Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü) tarafından desteklendi.

Tüm hayvanlar, Görme ve Oftalmik Araştırmalarda Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Houston Üniversitesi Optometri Üniversitesi hayvan işleme yönergelerinde açıklanan yönergelere göre ele alındı. Tüm hayvan prosedürleri ele alındıkları kurumlar tarafından onaylandı: Fare, sıçan, tavşan, kobay ve insan dışı primat prosedürleri Houston Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, zebra balığı prosedürleri DePauw Üniversit...

Bu yöntemlerin amacı, laboratuvarımızın yüksek çözünürlüklü seri elektron mikroskopi görüntülerini güvenilir bir şekilde yakalamasını sağlayan doku hazırlama ve görüntüleme metodolojisini vurgulamak ve SBF-SEM görüntülemesini yaparken oluşabilecek potansiyel tuzakların yanı sıra bu sonuca yol açan kritik adımlara dikkat çekmektir. Bu protokolün kullanılmasındaki başarı, dokunun düzgün bir şekilde sabitlenmesi, ağır metallerin numuneye emprenye edilmesi, şarjı azaltmak için g...

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) ilk olarak 1981 yılında Leighton tarafından reçineye gömülü dokunun ince bölümlerini kesebilen ve görüntüleyebilen dahili bir mikrotom ile artırılmış bir tarama elektron mikroskobu yaptığı açıklandı. Ne yazık ki, teknik sınırlamalar, biyolojik doku gibi iletken olmayan numuneler kabul edilemez şarj seviyeleri biriktirdiği için iletken numunelerle kullanımını kısıtladı (doku örneğinde elektron birikmesi)1. Buharlaştırılmış karbon azaltılmış doku şarjı ile kesimler arasındaki blok yüzünü kaplarken, bu büyük ölçüde artan görüntüleme alma süresi ve görüntü depolama, o zamanlar bilgisayar teknolojisi cihaz tarafından oluşturulan büyük dosya boyutlarını yönetmek için yetersiz olduğu için bir sorun olmaya devam etti. Bu metodoloji Denk ve Horstmann tarafından 2004 yılında değişken basınç odası2ile donatılmış bir SBF-SEM kullanılarak yeniden ele alındı. Bu, numune içindeki şarjı azaltan görüntüleme odasına su buharının girmesine izin verdi ve iletken olmayan örneklerin görüntülenmesini görüntü çözünürlüğü kaybına rağmen uygulanabilir hale getirdi. Doku hazırlama ve görüntüleme yöntemlerinde daha fazla iyileştirme artık yüksek vakum kullanılarak görüntülemeye izin verir ve SBF-SEM görüntüleme artık şarj 3 , 4,5,6,7,8,9'udağıtmak için su buharı güvenmez. SBF-SEM'de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir.
SBF-SEM, 3-5 nm10,11gibi küçük düzlemsel çözünürlüğe sahip binlerce seri kayıtlı elektron mikroskopi görüntülerinin otomatik olarak toplanmasına izin verir. Ağır metallerle emprenye edilen ve reçineye gömülü doku, elmas bıçakla donatılmış bir ultramikrotom içeren bir tarama elektron mikroskobuna (SEM) yerleştirilir. Elmas bıçakla düz bir yüzey kesilir, bıçak geri çekilir ve bloğun yüzeyi, doku ultrayapısının bir görüntüsünü oluşturmak için elektron ışını ile raster desende taranır. Blok daha sonra z ekseninde "z-adım" olarak bilinen belirli bir miktar (örneğin, 100 nm) yükseltilir ve işlem tekrarlanmadan önce yeni bir yüzey kesilir. Bu şekilde doku kesildikçe 3 boyutlu (3D) bir görüntü bloğu üretilir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından daha fazla yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar.
SBF-SEM görüntüleme öncelikle blok yüzün görüntüsünü oluşturmak için geri saçılmış elektronlar kullanırken, görüntüleme işlemi sırasında ikincil elektronlar üretilir12. İkincil elektronlar, bloktan kaçmayan geri saçılmış ve birincil ışınlı elektronların yanı sıra birikebilir ve blok yüzünde lokalize bir elektrostatik alana yol açabilecek "doku şarjı" üretebilir. Bu elektron birikimi görüntüyü bozabilir veya elektronların bloktan atılmasına neden olabilir ve geri teli dedektörü tarafından toplanan sinyale katkıda bulunarak sinyal-gürültü oranını13azaltır. Doku şarj seviyesi elektron ışını voltajı veya yoğunluğu azaltılarak veya ışın durma süresini azaltarak azaltılabilirken, bu sinyal-gürültü oranının azalmasına neden olur14. Daha düşük voltajlı veya yoğunlukta bir elektron ışını kullanıldığında veya kirişin her piksel alanında daha kısa bir süre kalmasına izin verildiğinde, dokudan daha az geri saçılmış elektron atilir ve elektron dedektörü tarafından yakalanır ve daha zayıf bir sinyalle sonuçlanır. Denk ve Horstmann, bu sorunu odaya su buharı sokarak ele aldı, böylece görüntü çözünürlüğü pahasına odadaki ve blok yüzündeki yükü azalttı. 10-100 Pa oda basıncı ile, elektron ışınının bir kısmı görüntü gürültüsüne ve çözünürlük kaybına katkıda bulunan dağınıktır, ancak bu aynı zamanda numune bloğu2içindeki yükü nötralize eden numune odasında iyonlar üretir. Numune bloğu içindeki yükü nötralize etmek için daha yeni yöntemler, görüntüleme sırasında blok yüzü üzerinde azot odak gazı enjeksiyonu veya prob-ışınlı kepçe enerjisini azaltmak ve toplanan sinyali artırmak için SBF-SEM aşamasına negatif voltaj getirmek içinkullanır 6,7,15. Blok yüzeyinde yük birikmesini azaltmak için sahne önyargısı, oda basıncı veya lokalize azot enjeksiyonu getirmek yerine, daha agresif görüntüleme ayarlarına izin vererek reçine karışımına karbon sokarak reçinenin iletkenliğini artırmak da mümkündür16. Aşağıdaki genel protokol, 2010 yılında yayınlanan Deerinck ve ark. protokolünün bir uyarlamasıdır ve yüksek çözünürlüklü görüntü alımını korurken doku şarjını en aza indirmek için yararlı bulduğumuz doku hazırlama ve görüntüleme metodolojilerinde yapılan değişiklikleri kapsar3,17,18,19. Daha önce bahsedilen protokol doku işleme ve ağır metal emprenyesine odaklanırken, bu protokol SBF-SEM çalışmalarının doğasında bulunan görüntüleme, veri analizi ve rekonstrüksiyon iş akışı hakkında fikir vermektedir. Laboratuvarımızda bu protokol kornea ve ön segment yapıları da dahil olmak üzere çok çeşitli dokulara başarıyla ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanmıştır, göz kapağı, lakrimal ve sert bezi, retina ve optik sinir, kalp, akciğer ve hava yolu, böbrek, karaciğer, cremaster kası ve serebral korteks / medulla ve fare, sıçan, tavşan, kobay, balık, monolayer ve tabakalı hücre kültürleri, domuz, insan olmayan primat ve insan20 , 21,22,23dahil olmak üzere çeşitli türlerde. Küçük değişiklikler belirli dokular ve uygulamalar için değerli olsa da, bu genel protokol temel görüntüleme tesisimiz bağlamında son derece tekrarlanabilir ve yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 x 3/8 Aluminum Rivets</td>
			<td>Industrial Rivet &#38; Fastener Co.</td>
			<td>6N37RFLAP/1100</td>
			<td>Used as specimen pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm Flathead Screwdriver</td>
			<td>Wiha Quality Tools</td>
			<td>27225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 10000</td>
			<td>Used to dilute silver paint.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Silver Paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged Razors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM</td>
			<td>Gatan &#38; Tescan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72630-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Super Glue - Impact Tough</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refered to as cyanoacrylate glue in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketjen Black</td>
			<td>HM Royal</td>
			<td>EC-600JD</td>
			<td>Refered to as carbon black in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>18-605-593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L62-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>BioWave Pro</td>
			<td>This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Embedding Mold</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td>Used to make specimen pin storage tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Pattern Needle Files</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruction Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>ImageJ.net</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser (MIB)</td>
			<td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstuct Software</td>
			<td>Neural Systems Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRVoS Workbench</td>
			<td>Diamond Light Source &#38; The University of Nottingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass</td>
			<td>IstoVisio, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbf-sem) of biological tissue samples

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM), doku mikroatominin eşi görülmemiş üç boyutlu görünümünü sunan yüzlerce ila binlerce seri kayıtlı ultrayapısal görüntünün toplanmasına izin verir. SBF-SEM'de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar. Bununla birlikte, uygun doku hazırlığı olmadan hücresel ultrayapı, yanlış veya yanıltıcı sonuçlar çıkarılacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, görüntüler reçine gömülü biyolojik örneğin blok yüzünün taranarak oluşturulur ve bu genellikle ele alınması gereken zorluklar ve hususlar sunar. "Doku şarjı" olarak bilinen görüntüleme sırasında blok içinde elektronların birikmesi, kontrast kaybına ve hücresel yapıyı takdir edememesine neden olabilir. Ayrıca, elektron ışını yoğunluğunu / voltajını artırmak veya ışın tarama hızını azaltmak görüntü çözünürlüğünü artırabilirken, bu aynı zamanda reçine bloğuna zarar vermenin ve görüntüleme serisindeki sonraki görüntüleri bozmanın talihsiz yan etkisine sahip olabilir. Burada hücresel ultrayapıyı koruyan ve doku şarjını azaltan biyolojik doku örneklerinin hazırlanması için rutin bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, doku bloğunda en az hasarla yüksek kaliteli seri görüntülerin hızlı bir şekilde elde edilmesi için görüntüleme hususları sağlıyoruz.

Fare Korneası Bu protokol fare korneasına kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. SBF-SEM görüntüleme kullanılarak, yetişkin fare korneası içinde elastin içermeyen mikrofibril demetlerden (EFMB) oluşan bir ağın mevcut olduğu gösterilmiştir. Daha önce bu ağın sadece embriyonik ve erken postnatal gelişim sırasında mevcut olduğuna inanılıyordu. SBF-SEM, kornea boyunca geniş bir EFMB ağı ortaya çıkardı ve kesit şeklinde ölçüldüğünde 100-200 nm çapında olduğu tespi...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM'in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi, üç boyutlu doku ultra yapılarının eşi görülmemiş bir görünümünü sağlar ve daha önce imkansız veya takip etmesi son derece zor olan bir dizi soruyu yanıtlayabilir. Bu teknik, minimum doku şarjı ve yapıtlarla üç boyutlu veri kümelerinin hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesini sağlar. Ve daha da önemlisi, günlük binlerce görüntünün otomatik olarak yakalanmasını sağlar.Standart iletim elektron mikroskopisi mükemmel hücresel ultra yapı sağlar. Ancak, bu görüntüler üç boyutlu bağlamdan yoksun ve yorumlanabilir. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi, karmaşık süreçlerin yorumlanmasını sağlayan üç boyutlu bağlam sağlar.Bu protokol güvenilir ve tekrarlanabilir olsa da, belirli adımlar hassasiyet gerektirir ve bu metodolojinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu video, bu kritik adımları ayrıntılı olarak gösterecektir. Örneklerin % 2,5 glutaraldehit ve iki milimoler kalsiyum klorür içeren 0,1 molar sodyum kakadot tamponunda sabitlendikten sonra, numuneler iki milimetreden daha büyük olmayan bloklar halinde kesilmeli ve iki milimoler kalsiyum klorür içeren 0,1 azı dişi sodyum kakadot tamponu ile yıkanmalıdır.Doku daha sonra ardışık olarak osmiyum ferrosiyanid, tiyokarbohidrazid ve osmiyum tetroksit ile lekelenir. Osmiyum tetroksit inkübasyonundan sonra, dokuyu bir gecede dört santigrat derecede% 1 sulu uranil asetat ile tedavi edin. Ertesi sabah, 0.03 molar aspartik asit çözeltisinin 10 mililitresinde 0.066 gram kurşun nitratı çözün ve Walton'un kurşun aspartat çözeltisinin pH'ını 5.5'e ayarlamak için normal bir potasyum hidroksit kullanın.Çözeltiyi fırında ısıttıktan sonra, dokuyu 60 santigrat dereceye aktarmadan önce oda sıcaklığında yıkama başına üç dakika boyunca beş kez yıkayın, çift damıtılmış su, Walton'un kurşun aspartat çözeltisini 60 santigrat derecede 30 dakika ısıttı. Kuluçkanın sonunda, dokuyu yıkayın ve yükselen, buz gibi bir aseton serisinde susuzlaştırın, ardından oda sıcaklığı asetonunda 10 dakikalık bir inkübasyon. Daha sonra dokuyu, dönen bir platformda dört saatlik bir infiltrasyon için asetonda 1:3 oranında sert karışık reçineye yerleştirin, ardından dönen bir platformda 1:1 reçine çözeltisine 1:1 oranında sekiz saatlik veya gece sızma, ardından dönen platformda 3:1 reçine oranında bir gece sızma.Ertesi sabah, dokuya %100 taze reçineyle 4-8 saat, bir gece ve oda sıcaklığında dönen bir platformda dört saatlik bir sızma için sızın. Ertesi sabah, reçine tozla doyurulana kadar az miktarda reçineyi karbon siyahı tozuyla karıştırmak için ahşap bir çubuk kullanın, ancak hala akışkandır ve grenli olmaz. Konut kalın mürekkebe benzemeli ve görünür kümeler olmadan yavaşça damlatabilmeli Doku örneğini silikon kauçuk kalıba yerleştirin ve reçine bloğu içindeki numune yönünün daha sonra referansı için bir görüntü yakalayın.Numune yerindeyken, silikon kalıbın ucundaki karbon siyahı doymuş reçinedeki dokuyu, reçinenin karşı ucundaki kalıptaki deneysel ve doku ayrıntılarını gösteren etiketle örtün. Daha sonra, kalıbı yaklaşık bir saat boyunca bir eğimde 65 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin. Karbon siyahı aşılanmış reçine yeterince iyileştiğinde, kalıbı fırından çıkarın ve boş bir kuyudan başlayarak, kalıbın geri kalanını net reçine ile doldurun, etiketin görünür kalmasına dikkat edin.Numune berrak reçine ile kaplandığında, silikon kalıbı bir eğime değil, 65 santigrat derece fırına 48 saat boyunca yerleştirin, ardından kalıbı çıkarın. Bloğu görüntülemeye hazırlamak için, reçine gömülü örneği konik ucu mandrenden yaklaşık beş ila altı milimetre yapışmış bir mikrotome aynaya yerleştirin. Numuneyi ayarlanan vida ile yerine kilitleyin ve numuneyi bir ısı lambasının altına yerleştirin.Birkaç dakika sonra, mandreni bir stereo mikroskop tutucusuna yerleştirin ve doku görünene kadar blok yüze paralel ince bölümler yapmak için yeni, çift kenarlı bir jilet kullanın, bu da reçinenin dokudan yoksun kısımlarına kıyasla daha az yansıtıcı ve ayrıntılı olacaktır. Kırpma pim tutucusuna bir alüminyum numune pimi sabitleyin ve numuneyi yerinde tutmak için kullanılan tutkal için daha geniş bir yüzey alanı sağlamak için pimin yüzünde birkaç derin, çaprazlama çizikleri yapın. Numuneyi bir ısı lambasının altına yerleştirin ve bloğun yaklaşık üç milimetre çapında iki ila üç milimetre yüksekliğinde olması için doku örneğinden fazla reçineyi kesmek için, bloğa eşit derinlikte ikinci, dik bir kesim yapmadan önce jileti bir ila iki milimetre doğrudan reçine bloğuna itin.Bu ilk kırpmadan sonra, ısı lambasının altındaki bloğu tekrar ısıtın ve reçine bloğunun üst kısmını tek bir pürüzsüz kesimde kesilmiş kısmın yaklaşık bir milimetre altında kesmek için yeni, çift kenarlı bir jilet kullanın. Kesilmiş alüminyum pim içeren kırpma pim tutucusunun stereomikroskop kabına yerleştirin ve pim yüzüne görünür bir menisküs oluşturmadan pimi tamamen kapacak şekilde ince bir siyanoakrilat tutkal tabakası uygulayın. Kesilmiş doku bloğu parçasını birkaç saniye boyunca numune pim yüzünün ortasına bastırmak için forseps kullanın ve tutkalın birkaç dakika ayarlanabilmesini bekleyin.Tutkal iyice kuruduğunda, reçine bloğunun yükseltilmiş kısmındaki dokuyu bulun ve doku örneğini içeren reçinenin yükseltilmiş kısmını bir milimetre kareden daha büyük olmayan bir alana kırpmak için çift kenarlı bir jilet kullanın. Yavaşça ve dikkatlice, mümkün olduğunca fazla reçineyi çıkarın, bloğu bir boyutta biraz daha uzun süre bırakın ve doku örneğini içeren yükseltilmiş kısmın dışındaki alandaki fazla reçineyi pimin kenarına doğru açılamak için son bir metal dosya kullanın. Tüm numune bloğu yüzeyine ince bir kat gümüş boya ve altın püskürtme uygulamadan önce hazırlanan numuneden reçine parçacıklarını ve tozları çıkarın.Kaplamadan sonra, blok yüzeylerinden fazla gümüş boyayı kesin ve monte edilmiş ve kesilmiş bloğu uygun etiket takılı özel yapım bir transfer pipet tüpünün soğanlı ucuna yerleştirin. SBF-SEM görüntüleme kullanılarak, yetişkin fare korneası içinde elastin içermeyen mikrofibril demetlerinden oluşan bir ağ tanımlanmıştır. Bu ağ, keratositlerle yakından ilişkili liflerle, hatta keratosit yüzeyinde sığ invaginasyonlar içinde yatan farklı katmanlarda düzenlenmiştir.Bu protokolün uygulanması, stromal-epitel sınırdaki bazal epitel hücreleriyle kaynaşan merkezi kornea sinirlerinin daha önce bilinmeyen bir popülasyonunun keşfedilmesine yol açmıştır. Merkezi korneanın SBF-SEM görüntülemesi, 3D rekonstrüksiyon için manuel olarak segmentlere ayırılabilen limbal vaskülat, sinir demetleri ve ilişkili hücrelerin varlığını ortaya koymaktadır. Bu görüntüleme prosedürünün bazı tuzakları, sonraki görüntülerin dalgalı ve bozulmalı olmasına, blok yüzünden küçük elektron deşarjlarına neden olabilecek, çizgilerde hızlı kontrast değişikliklerine, hasarlı bir bıçak nedeniyle blok yüzünde bıçak çiziklerine veya bıçağın kenarında döküntü birikmesine neden olabilen çok uzun bir piksel bekleme süresi kullanmayı içerir. , genişletilmiş bir elektron ışını kaynaklı eserler, numune henüz görüntüleme odasındayken blok yüze odaklanır, yanlış doku fiksasyonu, hücresel yapıların ve bağ dokusunun ayrılmasına yol açan ve doku veya reçine bloğu içinde çok miktarda şarj sonucu görüntü atlayan.Doku bloğunu keserken, doku bloğun içinde nerede olduğunu iyi anlamak önemlidir, böylece herhangi bir önemli örnek bölgeyi yanlışlıkla kırpmamak için. Belirli hücresel yapıların veya etkileşimlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntüleri istenirse, görüntüleme durdurulabilir, blok mikroskoptan çıkarılabilir ve bir iletim elektron mikroskobunda görüntülenebilecekleri bir ultramikrotom üzerinde kesilen bölümler Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi biyolojik dokuların tamamen benzersiz bir görünümünü sağlar. Bu protokolü kullanarak, kaliteli veri kümelerini hızla elde edebildik ve keşfedebileceğimiz doku yelpazesini genişletebildik.

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Seri Blok Yüz ve Odaklanmış Iyon ışını Scan Elektron Mikroskobu Kullanılarak Yapılan Hedefli Çalışmalar

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...