Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

De auteurs willen de gulle gevers van oogweefsels en het team van de Nieuw-Zeelandse National Eye Bank bedanken voor hun steun. Dit werk werd financieel ondersteund door projectsubsidies van de Maurice and Phyllis Paykel Trust en de Auckland Medical Research Foundation (1117015). Het directeurschap van IDR wordt ondersteund door de Buchanan Charitable Foundation. De beurs van CK wordt verstrekt door de New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) en de beurs van HHL wordt verstrekt door de Buchanan Charitable Foundation.

Menselijke donoroogcups werden verkregen van de Nieuw-Zeelandse National Eye Bank na cornea-excisie voor transplantatie en zoals goedgekeurd door de Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
OPMERKING: De kweek moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II om steriele weefselkweekomstandigheden te garanderen. De weefsels moeten binnen 24 uur postmortem worden gekweekt om significant verlies van retinale integriteit te voorkomen.
<p class="jove...

<ol>
	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan.">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li><li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy.">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li><li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+(HORFC)+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11.">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina.">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li><li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+to+study+retinal+neurodegeneration.">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li><li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium.">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li><li>Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro.">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li><li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice:+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy.">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).</li><li>. R&amp;D Systems, I Available from: <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020)</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li><li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">M&#252;ller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li><li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+explant+culture:+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina.">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li><li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta,+IL-6,+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy.">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li><li>Lee, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy.">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li><li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy.">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li><li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+interleukin+12+(IL-12),+interferon-inducible+protein+10+(IP-10)+and+Interleukin+18+(IL-18)+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy.">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li><li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy.">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li><li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC is momenteel het meest klinisch vertaalbare model in preklinisch retinaal onderzoek. In vergelijking met in vitro celkweekmodellen kan HORC de anatomie van het menselijk netvlies in situ beter weergeven, door de dynamische retinale celtypen en hun verbindingen met neuronen, vasculaturen en de extracellulaire omgeving te behouden19. In vergelijking met diermodellen is HORC voordeliger bij het bestuderen van de pathofysiologie van en het ontwerpen van farmaceutische behandelingen voor menselijk...

Het netvlies is een zeer gespecialiseerde oculaire structuur die verantwoordelijk is voor het transformeren van inkomende lichtenergie naar elektrische signalen, die vervolgens door de hersenen worden verwerkt voor visuele waarneming. Het menselijk netvlies bevat een dynamisch bereik van celtypen, sterk georganiseerd in een unieke lamellaire structuur bestaande uit twee synaptische en drie kernlagen1 (Figuur 1). Retinale homeostase wordt ondersteund door de ingewikkelde verbindingen tussen neuroretinale cellen, bloedvaten, zenuwen, bindweefsels en de RPE1. Vanwege de geavanceerde retinale anatomie en fysiologie blijven de mechanismen van veel netvliesaandoeningen nog steeds slecht begrepen2,3,4,5. Om netvliesaandoeningen beter te bestuderen, zijn HORC-modellen ontwikkeld6,7,8,9. In vergelijking met dierstudies en in vitro culturen zijn HORC-modellen voordelig omdat ze de dynamische cellulaire omgeving en complexe neurovasculaire interacties in situ behouden, wat een goed model biedt voor klinische translatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Figuur 1: Posterieure oculaire structuren van het menselijk oog. De retinale lagen van voor naar achteren zijn: zenuwvezellaag (NFL), ganglioncellaag (GCL), binnenste plexiforme laag (IPL), binnenste nucleaire laag (INL), buitenste plexiforme laag (OPL), buitenste nucleaire laag (ONL), fotoreceptor binnenste segment (IS) en fotoreceptor buitenste laag (OS). Cellen in het netvlies omvatten ganglioncellen (blauw), amacrinecellen (geel), bipolaire cellen (rood), horizontale cellen (paars), staaffotoreceptoren (roze) en kegelfotoreceptoren (groen). Het glasvocht bevindt zich anterieur aan het netvlies. De RPE, bruch's membraan, vaatvlies en sclera bevinden zich achter het netvlies. Merk op dat de getoonde afbeelding slechts een schematische weergave is van het netvlies en dat de verhouding tussen cellen en retinale connectiviteit binnen elke laag mogelijk niet indicatief is voor de in vivo setting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Eerder gekarakteriseerde HORC-protocollen6,7,8,9 hebben betrekking op het scheiden van het netvlies van het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera met behulp van een chirurgische trephine. Zonder de ondersteuning van deze onderliggende structuren wordt het doorschijnende netvlies echter dun, moeilijk te hanteren en kunnen hulpmiddelen zoals een tang de integriteit ervan gemakkelijk verstoren. Bovendien is aangetoond dat het isoleren van het netvlies in cultuur zonder de RPE ganglioncelapoptose en fotoreceptordegeneratie10,11,12veroorzaakt. Een alternatief HORC-protocol dat het verlies van retinale integriteit minimaliseert en de in vivo omgeving beter nabootst, zou dus nuttig zijn. Dit is vooral belangrijk bij het bestuderen van retinale ziektemechanismen, omdat lichamelijk letsel tijdens explantbehandeling artefacten kan introduceren. Daarom was het doel van deze studie om een nieuw HORC-model te ontwikkelen dat het RPE-vaatvlies en sclera omvat om de retinale integriteit te beschermen tijdens explantbehandeling en kweek.
Om dit doel te bereiken, werden retinale explantaten "ingeklemd" tussen het resterende glasvocht en het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera geëxtraheerd. In de sandwich explanteert het glasvocht het netvlies om netvliesloslating en vouwen te voorkomen, terwijl de taaie, vezelige sclera fungeert als zowel een steiger voor structurele ondersteuning als een contactpunt voor een tang. Bovendien hebben diermodellen aangetoond dat het behouden van de RPE in cultuur retinale degeneratie en gliale proliferatie kan voorkomen, een reactie van Müller-cellen op gevaarsignalen zoals hypoxie en ontsteking10,11,12.
Om het model te karakteriseren, werden sandwich retinale explantaten gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H & E) om anatomische structuren te beoordelen en immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd, waarbij explantaten werden gelabeld met terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL, een apoptotische celmarker), glial fibrillair zuur eiwit (GFAP, een retinale ontsteking en Müller-celactiveringsmarker) en vimentine, een marker van Müller-celintegriteit. Om te bepalen of dit model kan worden geïnduceerd om moleculaire ziekteverschijnselen te ontwikkelen, werden de explantaten blootgesteld aan hoge glucose (HG) met pro-inflammatoire cytokines (Cyt), interleukine-1β (IL-1β) en tumornecrosefactor-α (TNF-α), een kweekomgeving waarvan is aangetoond dat deze diabetische retinopathie (DR) nabootst in zowel cel- als dierziektemodellen13,14,15. Luminex-assays werden gebruikt in het DR-model om cytokines te meten die vrijkomen in het kweekmedium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

Eerdere menselijke organotypische retinale cultuur (HORC) modellen hebben gebruik gemaakt van losse netvliezen; zonder de structurele ondersteuning die wordt verleend door retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera, kan de integriteit van het fragiele netvlies gemakkelijk worden aangetast. Het doel van deze studie was om een nieuw HORC-model te ontwikkelen dat het netvlies, RPE-vaatvlies en sclera bevat om de retinale integriteit te behouden bij het kweken van retinale explantaten.
Na het snijden omcirkelend langs de limbus om iris en lens te verwijderen, werden vier diepe incisies gemaakt om de oogschelp plat te maken. In tegenstelling tot eerdere HORC-protocollen werd een trephine gebruikt om niet alleen het netvlies door te snijden, maar ook het RPE-vaatvlies en sclera. De resulterende drielaagse explantaten werden gedurende 72 uur gekweekt. Hematoxyline en Eosine-kleuring (H&E) werd gebruikt om anatomische structuren te beoordelen en retinale explantaten werden verder gekenmerkt door immunohistochemie (IHC) voor apoptose, Müller-celintegriteit en retinale ontsteking. Om de mogelijkheid van ziekte-inductie te bevestigen, werden explantaten blootgesteld aan hoge glucose (HG) en pro-inflammatoire cytokines (Cyt), om diabetische retinopathie (DR) na te bootsen. De Luminex magnetische kraaltest werd gebruikt om DR-gerelateerde cytokines te meten die vrijkomen in het kweekmedium.
H&E-kleuring onthulde verschillende retinale lamellen en compacte kernen in retinale explantaten met het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera, terwijl netvliezen zonder de onderliggende structuren een verminderde dikte en ernstig kernverlies vertoonden. IHC-resultaten wezen op afwezigheid van apoptose en retinale ontsteking, evenals behoud van Müller-celintegriteit. De Luminex-assays toonden een significant verhoogde secretie van DR-geassocieerde pro-inflammatoire cytokines in retinale explantaten blootgesteld aan HG + Cyt ten opzichte van baseline niveaus na 24 uur.
We hebben met succes een nieuw HORC-protocol ontwikkeld en gekarakteriseerd waarin de retinale integriteit werd bewaard zonder apoptose of retinale ontsteking. Bovendien suggereert de geïnduceerde secretie van DR-geassocieerde pro-inflammatoire biomarkers bij blootstelling van retinale explantaten aan HG + Cyt dat dit model kan worden gebruikt voor klinisch vertaalbare retinale ziektestudies.

Retinale integriteit werd bewaard in dit HORC-model. Retinale integriteit bleef behouden in de gekweekte sandwich retinale explantaten, maar ging verloren in het netvlies gekweekt zonder aangrenzende structuren. H&E werd uitgevoerd om de structurele integriteit van gesegmenteerde sandwich retinale explantaten na 72 h in cultuur te onderzoeken. De sandwich retinale explantaten vertoonden een behouden integriteit en een duidelijke lamellenstructuur van GCL tot ONL met comp...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Deze techniek behoudt alle retinale lagen en celtypen in situ, waardoor het klinisch relevanter is in vergelijking met dier- en in vitro modellen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de verstoring van de retinale integriteit minimaliseert tijdens weefselbehandeling, wat essentieel is bij het vergelijken van gezond en ziek netvlies. Retinale ziekten kunnen worden nagebootst door het weefsel onder specifieke omstandigheden te kweken.Dit maakt het mogelijk om nieuwe medicamenteuze therapieën te testen. De ontledings- en monsterverzamelingsprocedures zijn complex. Daarom is visuele demonstratie van cruciaal belang om de lezers te helpen het geschreven protocol te begrijpen en de procedure met succes uit te voeren.De procedure wordt gedemonstreerd door Charisse Kuo, een tweedejaars promovendus uit mijn laboratorium. Bereid het kweekmedium met Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 en een eenmalig mengsel van antibiotica en antimycotica. Plaats eerst 500 microliter medium in een plaat met 24 putten en breng deze in evenwicht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Het gereed hebben van de media voorafgaand aan explantextractie voorkomt ontwrichting van het netvlies bij latere toevoeging. Voor het extraheren van retinale explantaten, begin met het plaatsen van de oogschelp op een petrischaal met de iris en lens naar boven gericht en de ONH die contact maakt met de petrischaal. Houd de oogschelp stabiel bij de limbus met behulp van een tang en maak de iris en lens los door kleine sneden te maken langs de buitenrand van de limbus.Verwijder de iris en lens voorzichtig en zorg ervoor dat u het netvlies niet verstoort. Identificeer de ONH met behulp van een helderwitte lichtbron en insnijs in de vier kwadranten naar de ONH die de petrischaal draait voor eenvoudiger gebruik. Verdeel en druk de oogschelp voorzichtig plat.Breng de tang aan op de sclera in plaats van op het netvlies om te voorkomen dat de integriteit van het netvlies wordt verstoord. Verwijder de plaat met de bereide media uit de couveuse. Plaats een chirurgische trephine op het netvlies in een gebied zonder netvliesplooien en druk hard om de sclera binnen te dringen, wat een krakend geluid zou moeten genereren als je door de petrischaal breekt.Draai de trephine om ervoor te zorgen dat de sclera volledig is doordrongen, zodat de retinale explant nu gescheiden is van de rest van het monster. Breng de tang aan op de sclera en breng de sandwich retinale explant over naar het kweekmedium. Kweek de verzamelde sandwich retinale explanteert bij 37 graden Celsius gedurende maximaal 72 uur in een bevochtigde incubator van 5% koolstofdioxide.Hematoxyline- en eosinekleuring toonden aan dat de sandwich retinale explantaten de integriteit en een duidelijke lamellenstructuur van de GCL tot de ONL met compacte kernen in de binnenste en buitenste nucleaire lagen behielden. Verstoorde retinale integriteit werd gevonden aan de randen van hetzelfde monster waar het netvlies zich had losgemaakt van het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera met verminderde retinale dikte en verlies van kernen in de INL en ONL. Er werden geen TUNEL-positieve celkernen, die cellulaire apoptose markeren, gevonden in retinale explantaten gekweekt in basale omstandigheden, wat aanhoudende cellulaire vitaliteit aantoont, zelfs na 72 uur.GFAP-etikettering was beperkt tot de GCL en de IPL zonder gliale fibrose, een teken van pathologie dat zou worden geïdentificeerd als uitgebreide expressie van GFAP in de ONL. Vimentine kwam sterk tot expressie van de ganglioncellaag tot de buitenste nucleaire laag, met behoud van Mueller-celintegriteit zoals te zien in normale retinale weefsels. Luminex magnetische assay toonde aan dat de IL-18, VEGF, IL-6 en IL-8 niveaus significant boven baseline stegen in de sandwich retinale explantculturen in hoge glucose en pro-inflammatoire cytokines na 24 uur.Na 72 uur bleven de IL-18- en VEGF-niveaus significant verhoogd, maar er werd geen significant verschil gevonden in IL-6- en IL-8-niveaus. Laat bij het uitvoeren van deze procedure voldoende restant glasvocht achter, dat het netvlies zal verzwaren zodat het niet loskomt van het RP-vaatvlies en in de kweekmedia zweeft. Het gekweekte netvlies kan verder worden gekarakteriseerd met behulp van immunohistochemie en histologie, terwijl de inflammatoire cytokines die vrijkomen in het gekweekte medium kunnen worden gemeten met behulp van een Luminex magnetische test.Dit model is klinisch beter vertaalbaar in vergelijking met dier- en in vitro modellen, waardoor het meer geschikt is voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische geneesmiddelen voor netvliesaandoeningen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Rescue Technique for Difficult Intubation and Difficult Ventilation

A Novel Rescue Techniek voor Moeilijke intubatie en Moeilijke Ventilatie

We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

A Novel Capsulorhexis Technique Using Shearing Forces with Cystotome

A Novel capsulorhexis techniek met behulp van schuifkrachten met Cystotome

Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

Een nieuwe techniek van het redden van capsulorhexis Radial Tear-out met behulp van een Cystotome

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Een vereenvoudigde methode voor<em&gt; In situ</em&gt; Excisie van het hoornvlies en het verwijderen van de ingewanden van retinaal weefsel van Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Een gedetailleerd protocol voor het Zweet Monitoring Met behulp van een roman, Kleine, draadloze apparaten

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...