Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לתורמים הנדיבים של רקמות עיניים ולצוות מבנק העיניים הלאומי של ניו זילנד על תמיכתם. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענקי פרויקטים מקרן מוריס ופיליס פיקל וקרן המחקר הרפואי של אוקלנד (1117015). הדירקטוריון של IDR נתמך על ידי קרן הצדקה ביוקנן. המלגה של CK ניתנת על ידי האגודה הניו זילנדית לחינוך ומחקר של האופטומטריסטים (CC36812) והמלגה של HHL ניתנת על ידי קרן הצדקה ביוקנן.

כוסות עיניים של תורמים אנושיים התקבלו מבנק העיניים הלאומי של ניו זילנד לאחר כריתת קרנית להשתלה וכפי שאושר על ידי ועדת האתיקה לבריאות ונכות צפון B (NTX/06/19/CPD/AM07).
הערה: התרבות צריכה להיעשות בארון בטיחות ביולוגית Class II כדי להבטיח תנאי תרבית רקמות סטריליים. הרקמות חייבות להיות בתר...

<ol>
	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan.">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li><li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy.">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li><li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+(HORFC)+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11.">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina.">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li><li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+to+study+retinal+neurodegeneration.">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li><li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium.">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li><li>Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro.">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li><li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice:+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy.">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).</li><li>. R&amp;D Systems, I Available from: <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020)</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li><li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">M&#252;ller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li><li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+explant+culture:+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina.">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li><li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta,+IL-6,+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy.">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li><li>Lee, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy.">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li><li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy.">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li><li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+interleukin+12+(IL-12),+interferon-inducible+protein+10+(IP-10)+and+Interleukin+18+(IL-18)+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy.">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li><li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy.">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li><li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC הוא כיום המודל הניתן לתרגום קליני ביותר במחקר רשתית פרה-קלינית. בהשוואה למודלים של תרבית תאי הפריה, HORC יכול לייצג טוב יותר את האנטומיה של הרשתית האנושית במקום, באמצעות שמירה על סוגי תאי הרשתית הדינמיים והקשרים שלהם עם נוירונים, כלי דם והסביבה החוץ תאית19. בהשוואה למודלים של ?...

הרשתית היא מבנה עיני מיוחד מאוד האחראי על הפיכת אנרגיית אור נכנסת לאותות חשמליים, אשר מעובדים לאחר מכן על ידי המוח לתפיסה חזותית. הרשתית האנושית מכילה מגוון דינמי של סוגי תאים, מאורגן מאוד במבנה lamellar ייחודי המורכב משתישכבות סינפטיות ושלוש גרעינים 1 (איור 1). הומאוסטזיס ברשתית מתקיים על ידי הקשרים המורכבים בין תאים עצביים, כלי דם, עצבים, רקמות חיבור ו RPE1. בשל האנטומיה והפיזיולוגיה המתוחכמות של הרשתית, מנגנונים של מחלות רשתית רבות עדיין נשארים מובנים היטב2,3,4,5. כדי לחקור טוב יותר מחלות רשתית, מודלים HORC פותחו6,7,8,9. בהשוואה למחקרים בבעלי חיים ותרבויות במבחנה, מודלים HORC הם יתרון כי הם שומרים על הסביבה התאית הדינמית ואינטראקציות נוירווסקולריות מורכבות במקום, מתן מודל טוב לתרגום קליני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> איור 1: מבנים עיניים אחוריים של העין האנושית. שכבות הרשתית הקדמיות הקדמיות הן: שכבת סיבי עצב (NFL), שכבת תא גנגליון (GCL), שכבת plexiform פנימית (IPL), שכבה גרעינית פנימית (INL), שכבת plexiform חיצונית (OPL), שכבה גרעינית חיצונית (ONL), קטע פנימי של קולטן פוטו (IS) ושכבה חיצונית פוטורצפטור (OS). תאים בתוך הרשתית כוללים תאי גנגליון (כחול), תאי אמקרין (צהוב), תאים דו קוטביים (אדום), תאים אופקיים (סגול), קולטני מוט (ורוד) ופוטרצפטורים חרוט (ירוק). הזגית ממוקמת כמטרית לרשית. RPE, הממברנה של ברוך, choroid ו sclera ממוקמים אחוריים הרשתית. שים לב שהתמונה המוצגת היא רק ייצוג סכמטי של הרשתית והיחס בין התאים/קישוריות הרשתית בתוך כל שכבה עשוי שלא להעיד על ההגדרה in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בעבר אפיינו פרוטוקולי HORC6,7,8,9 מעורבים בהפרדת הרשתית מן RPE-choroid הבסיסי ו sclera באמצעות טרפין כירורגי. עם זאת, ללא התמיכה שמספקים מבנים בסיסיים אלה, הרשתית השקוף הופכת דקיקה, קשה לטיפול וכלים כגון מלקחיים יכולים בקלות לשבש את שלמותה. יתר על כן, בידוד רשתית בתרבות ללא RPE הוכח לגרום אפופטוזיס תא גנגליון ניוון פוטורצפטור10,11,12. לכן, פרוטוקול HORC חלופי שממזער את אובדן שלמות הרשתית ומחקה טוב יותר את סביבת in vivo יהיה שימושי. זה חשוב במיוחד כאשר לומדים מנגנוני מחלת הרשתית, כמו פגיעה גופנית במהלך טיפול explant יכול להציג חפצים. לכן, מטרת המחקר הזה הייתה לפתח מודל HORC חדשני הכולל את RPE-choroid ו sclera על מנת להגן על שלמות הרשתית במהלך טיפול explant ותרבות.
על מנת להשיג מטרה זו, explants רשתית "סנדוויץ'" בין הזגוזית שיורית ואת הבסיסי RPE-choroid ו sclera חולצו. בגולשי הכריך, הזגוכית מכבידה על הרשתית כדי למנוע ניתוק רשתית וקיפול, ואילו הסקלרה הקשוחה והסיבית משמשת גם כפיגומים לתמיכה מבנית וגם כנקודת מגע למלקחיים. יתר על כן, מודלים בעלי חיים הראו כי שמירה על RPE בתרבות יכול למנוע ניוון רשתית והתפשטות גליה, תגובה של תאי מולר לאותות סכנה כגון היפוקסיה ודלקת10,11,12.
כדי לאפיין את המודל, בוצעו explants רשתית כריך עם תיוג קצה ניק dematoxylin ו- Eosin (H&E) כדי להעריך מבנים אנטומיים וחיסון חיסוני (IHC), תיוג explants עם מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק סוף תיוג (TUNEL, סמן תא אפופוטוטי), חלבון חומצי סיביה (GFAP, דלקת רשתית וסמן הפעלת תא מולר), ו vimentin, סמן של שלמות התא מולר. כדי לקבוע אם מודל זה יכול להיות מושרה לפתח סימני מחלה מולקולרית, explants נחשפו גלוקוז גבוה (HG) עם ציטוקינים פרו דלקתיים (Cyt), אינטרלוקין-1β (IL-1β) וגורם נמק הגידול α (TNF-α), סביבת פולחן שהוכח לחקות רטינופתיה סוכרתית (DR) במודלים של מחלות תאים ובעלי חיים13,14,15. מבדקי Luminex שימשו במודל DR למדידת ציטוקינים ששוחררו למדיום התרבותי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

דגמי תרבות הרשתית האורגנוטיפית האנושית הקודמת (HORC) השתמשו ברשתיות מנותקות; עם זאת, ללא התמיכה המבנית המוענקת על ידי אפיתל פיגמנט רשתית-choroid (RPE-choroid) ו sclera, השלמות של הרשתית שבירה יכול בקלות להיות בסכנה. מטרת המחקר הזה הייתה לפתח מודל HORC חדשני המכיל את הרשתית, RPE-choroid ו sclera כדי לשמור על שלמות הרשתית בעת פולחן explants רשתית.
לאחר חיתוך היקפי לאורך הלימבוס כדי להסיר קשתית ועדשה, ארבעה חתכים עמוקים נעשו כדי לשטח את העין. בניגוד לפרוטוקולים קודמים של HORC, נעשה שימוש בטרפין כדי לחתוך לא רק את הרשתית אלא גם את RPE-choroid ו sclera. המהדורות המשולשות שהתקבלו היו בתרבית במשך 72 שעות. ההמטוקסילין והכתמת אאוזין (H&E) שימשו להערכת מבנים אנטומיים ו explants ברשתית התאפיינו עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) עבור אפופטוזיס, שלמות התא מולר ודלקת ברשתית. כדי לאשר את האפשרות של אינדוקציה המחלה, explants נחשפו גלוקוז גבוה (HG) וציטוקינים פרו דלקתיים (Cyt), כדי לחקות רטינופתיה סוכרתית (DR). חרוזים מגנטיים Luminex שימש למדידת ציטוקינים הקשורים DR שוחרר לתוך המדיום התרבותי.
כתמי H&E חשפו לאמלי רשתית ברורה וגרפיעים קומפקטיים בגרשי רשתית עם RPE-choroid ו sclera הבסיסיים, בעוד רשתיות ללא המבנים הבסיסיים הציגו עובי מופחת ואובדן גרעינים חמור. תוצאות IHC הצביעו על היעדר אפופטוזיס ודלקת ברשתית, כמו גם על שלמות תאי מולר שנשמרה. בדיקות Luminex הראו הפרשה מוגברת באופן משמעותי של ציטוקינים פרו דלקתיים הקשורים DR ב explants ברשתית שנחשפו HG + Cyt ביחס לרמות הבסיס ב 24 שעות.
פיתחנו ואיפיינו בהצלחה פרוטוקול HORC חדשני שבו שלמות הרשתית נשמרה ללא אפופטוזיס או דלקת ברשתית. יתר על כן, הפרשה המושרה של סמנים ביולוגיים פרו דלקתיים הקשורים DR בעת חשיפת explants רשתית HG + Cyt מציע כי מודל זה יכול לשמש למחקרי מחלות רשתית לתרגום קליני.

שלמות הרשתית נשמרה במודל HORC זה. שלמות הרשתית נשמרה ברשתית הכריכים התרבותית אך אבדה ברשתית בתרבית ללא מבנים סמוכים. H&E נערך כדי לבחון את השלמות המבנית של explants רשתית כריך חתך לאחר 72 שעות בתרבות. מגרשי רשתית הכריכים הראו שלמות משומרת ומבנה lamellae מובחן מ- GCL ל- ONL עם גרע...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

טכניקה זו משמרת את כל שכבות הרשתית וסוגי התאים במקום, מה שהופך אותה לרלוונטית יותר מבחינה קלינית בהשוואה למודלים של בעלי חיים ומוחן. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא ממזער הפרעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול ברקמות, החיוניות בעת השוואת רשתית בריאה וחולים. מחלות רשתית ניתן להחיות על ידי פולחן הרקמה בתנאים ספציפיים.זה מאפשר בדיקה של טיפולים תרופתיים חדשים. הליכי הניתוח והאיסוף לדוגמה מורכבים. לכן, הדגמה חזותית היא קריטית כדי לעזור לקוראים להבין את הפרוטוקול הכתוב ולנהל את ההליך בהצלחה.מדגים את ההליך יהיה צ'ריס קו, סטודנט שנה שנייה לדוקטורט מהמעבדה שלי. הכן את המדיום התרבותי המכיל את תערובת הנשר הבינוני/מודין F-12 של Dulbecco ותערובת אנטיביוטיקה ותרופות אנטי-מיקוטיקה. ראשית, למקם 500 microliters של בינוני בצלחת 24-well וישית אותו בחממה לחה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.הכנת התקשורת לפני החילוץ המסביר נמנעת מהתנתקות מהרשתית עם התוספת הבאה. לחילוץ פסולת רשתית, התחילו בהנחת העיית על צלחת פטרי עם הקשתית והעדשה הפונה כלפי מעלה וה- ONH יוצר קשר עם צלחת הפטרי. החזק את העין יציבה בלימבוס באמצעות מלקחיים וניתק את הקשתית והעדשה על ידי ביצוע חתכים קטנים בהיקף לאורך הקצה החיצוני של הלימבוס.הסר את הקשתית ואת העדשה בזהירות, הקפדה להימנע הפרעה הרשתית. זהה את ה- ONH באמצעות מקור אור לבן בוהק וסיתע בארבעת הרבעים לכיוון ה- ONH המסובב את צלחת הפטרי לטיפול קל יותר. מורחים ומשטחים את העית בזהירות.החל את המלקחיים על הסקלרה במקום הרשתית כדי למנוע שיבוש שלמות הרשתית. הסר את הצלחת המכילה את המדיה המוכנה מן האינקובטור. מניחים טרפין כירורגי על הרשתית באזור ללא קפלי רשתית ולוחצים חזק כדי לחדור את הסקלרה, אשר אמור ליצור צליל פיצוח כפי שאתה לשבור את צלחת פטרי.סובב את הטרפין כדי להבטיח שהסקלרה חדרה במלואה כך שגירוש הרשתית מופרד כעת משאר המדגם. החל את המלקחיים על sclera ולהעביר את explant רשתית כריך למדיום התרבות. תרבות רשתית הכריכים שנאספו ב-37 מעלות צלזיוס עד 72 שעות בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני.כתמי המטוקסילין ואוסין הראו כי רשתות הכריך שמרו על שלמות ומבנה lamellae מובחן מה- GCL ועד ה- ONL עם גרעינים קומפקטיים בשכבות הגרעיניות הפנימיות והחיצוניות. שלמות רשתית משובשת נמצאה בשולי אותה מדגם שבו הרשתית התנתקה מהכורואיד והסקלרה הבסיסיים המציגים עובי רשתית מופחת ואובדן גרעינים ב- INL וב- ONL. לא נמצאו גרעיני תאים חיוביים TUNEL, המסמן אפופטוזיס תאי, נמצאו explants רשתית תרבית בתנאים בסיסיים, להפגין חיוניות תאית מתמשכת גם לאחר 72 שעות.תיוג GFAP הוגבל ל- GCL ול- IPL ללא פיברוזיס גליה, סימן לפתולוגיה אשר יזוהה כביטוי מורחב של GFAP לתוך ONL. Vimentin התבטא מאוד משכיית תא הגנגליון לשכבה הגרעינית החיצונית, מראה שלמות תא מולר השתמר כפי שניתן לראות ברקמות רשתית נורמליות. בדיקת מג'ייז מגנטית Luminex הראתה כי IL-18, VEGF, IL-6 ו- IL-8 גדלו באופן משמעותי מעל קו הבסיס בתרביות explant רשתית כריך גלוקוז גבוה וציטוקינים פרו דלקתיים לאחר 24 שעות.לאחר 72 שעות, רמות IL-18 ו-VEGF נותרו גבוהות משמעותית, אך לא נמצא הבדל משמעותי ברמות IL-6 ו-IL-8. בעת ביצוע הליך זה, להשאיר מספיק שרץ שיורית, אשר ישקול את הרשתית למטה, כך שהוא לא להתנתק choroid RP לצוף בתקשורת התרבות. הרשתית התרבותית יכולה להיות מאופיינת עוד יותר באמצעות אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה, בעוד שניתן למדוד את הציטוקינים הדלקתיים המשתחררים למדיום התרבותי באמצעות בדיקה מגנטית של Luminex.מודל זה ניתן לתרגום קליני יותר בהשוואה למודלים של בעלי חיים ומבחנה, מה שהופך מתאים יותר לבדיקת היעילות של תרופות טיפוליות חדשניות למחלות רשתית.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Rescue Technique for Difficult Intubation and Difficult Ventilation

הצלה רומן טכניקה אינטובציה קשה אוורור קשה

We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

A Novel Capsulorhexis Technique Using Shearing Forces with Cystotome

Capsulorhexis רומן טכניקה באמצעות כוחות הגז עם Cystotome

Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

טכניקה חדשנית של Capsulorhexis הצלת מחוגי מדמיע-out באמצעות Cystotome

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

טכניקה פשוטה עבור<em&gt; באתרו</em&gt; כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב Ocular האדם

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

פרוטוקול מפורט עבור ניטור זיעה באמצעות רומן, קטן, מכשיר אלחוטי

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...