Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Forfatterne vil takke de sjenerøse donorene av øyevev og teamet fra New Zealand National Eye Bank for deres støtte. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av prosjektstipend fra Maurice and Phyllis Paykel Trust og Auckland Medical Research Foundation (1117015). IDRs styreverv støttes av Buchanan Charitable Foundation. CK sitt stipend er gitt av New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) og HHL sitt stipend er levert av Buchanan Charitable Foundation.

Human donor øye kopper ble hentet fra New Zealand National Eye Bank etter hornhinnen eksisjon for transplantasjon og som godkjent av Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
MERK: Kulturen bør gjøres i et biosikkerhetsskap i klasse II for å sikre sterile vevskulturforhold. Vevet må dyrkes innen 24 timer etter mortem for å unngå betydelig tap av retinal integritet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/...

<ol>
	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan.">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li><li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy.">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li><li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+(HORFC)+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11.">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina.">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li><li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+to+study+retinal+neurodegeneration.">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li><li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium.">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li><li>Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro.">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li><li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice:+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy.">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).</li><li>. R&amp;D Systems, I Available from: <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020)</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li><li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">M&#252;ller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li><li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+explant+culture:+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina.">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li><li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta,+IL-6,+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy.">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li><li>Lee, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy.">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li><li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy.">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li><li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+interleukin+12+(IL-12),+interferon-inducible+protein+10+(IP-10)+and+Interleukin+18+(IL-18)+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy.">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li><li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy.">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li><li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC er for tiden den mest klinisk overførbare modellen i preklinisk retinal forskning. Sammenlignet med in vitro cellekulturmodeller, kan HORC bedre representere anatomien til den menneskelige netthinnen in situ, gjennom å beholde de dynamiske netthinnecelletypene og deres forbindelser med nevroner, vaskulaturer og det ekstracellulære miljøet19. Sammenlignet med dyremodeller er HORC mer fordelaktige i å studere patofysiologien til og designe farmasøytiske behandlinger for menneskelige netth...

Netthinnen er en høyt spesialisert okulær struktur som er ansvarlig for å transformere innkommende lysenergi til elektriske signaler, som deretter behandles av hjernen for visuell oppfatning. Den menneskelige netthinnen inneholder et dynamisk utvalg av celletyper, høyt organisert i en unik lamellstruktur som består av to synaptiske og tre nukleilag1 (figur 1). Retinal homeostase opprettholdes av de intrikate forbindelsene mellom nevroretinale celler, blodkar, nerver, bindevev og RPE1. På grunn av den sofistikerte retinal anatomien og fysiologien forblir mekanismer for mange netthinnesykdommer fortsatt dårlig forstått2,3,4,5. For bedre å studere netthinnesykdommer er HORC-modeller utviklet6,7,8,9. Sammenlignet med dyrestudier og in vitrokulturer, er HORC-modeller fordelaktige fordi de beholder det dynamiske cellulære miljøet og komplekse nevrovaskulære interaksjoner in situ, noe som gir en god modell for klinisk oversettelse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Figur 1: Bakre okulære strukturer i det menneskelige øye. Fremre til bakre, retinal lag er: nerve fiber lag (NFL), ganglion cellelag (GCL), indre plexiform lag (IPL), indre kjernefysisk lag (INL), ytre plexiform lag (OPL), ytre kjernefysisk lag (ONL), fotoreseptor indre segment (IS), og photoreceptor ytre lag (OS). Celler i netthinnen inkluderer ganglionceller (blå), amacrine celler (gul), bipolare celler (rød), horisontale celler (lilla), stang fotoreseptorer (rosa) og kjegle fotoreseptorer (grønn). Glasslegemet ligger fremre til netthinnen. RPE, Bruchs membran, choroid og sclera ligger bakre til netthinnen. Vær oppmerksom på at bildet som vises, bare er en skjematisk representasjon av netthinnen, og forholdet mellom celler/netthinnetilkobling i hvert lag er kanskje ikke en indikasjon på in vivo-innstillingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tidligere karakteriserte HORC protokoller6,7,8,9 har involvert å skille netthinnen fra underliggende RPE-choroid og sclera ved hjelp av en kirurgisk trefin. Men uten støtten fra disse underliggende strukturene blir den gjennomsiktige netthinnen spinkel, vanskelig å håndtere og verktøy som tang kan lett forstyrre integriteten. Videre isolerer netthinnen i kulturen uten RPE har vist seg å forårsake ganglion celle apoptose og fotoreseptor degenerasjon10,11,12. Dermed vil en alternativ HORC-protokoll som minimerer tap av netthinneintegritet og bedre etterligner in vivo-miljøet være nyttig. Dette er spesielt viktig når du studerer retinal sykdomsmekanismer, da fysisk skade under utvisende håndtering kan introdusere artefakter. Derfor var målet med denne studien å utvikle en ny HORC-modell som inkluderer RPE-choroid og sclera for å beskytte netthinneintegritet under utvisende håndtering og kultur.
For å oppnå dette målet ble retinal explants "sandwiched" mellom gjenværende glasslegeme og underliggende RPE-choroid og sclera ekstrahert. I smørbrødet veier glasslegemet ned netthinnen for å forhindre netthinneavløsning og folding, mens den tøffe, fibrøse scleraen fungerer som både et stillas for strukturell støtte og et kontaktpunkt for tang. Videre har dyremodeller vist at å beholde RPE i kulturen kan forhindre retinal degenerasjon og glial spredning, et svar fra Müller-celler til faresignaler som hypoksi og betennelse10,11,12.
For å karakterisere modellen ble sandwich retinal explants farget med Hematoxylin og Eosin (H&E) for å vurdere anatomiske strukturer og immunhiistokjemi (IHC) ble utført, merking explants med terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end merking (TUNEL, en apoptotisk cellemarkør), glial fibrillary surt protein (GFAP, en retinal betennelse og Müller celleaktivering markør), og vimentin, en markør for Müller celleintegritet. For å avgjøre om denne modellen kan induseres for å utvikle molekylære sykdomstegn, explants ble utsatt for høy glukose (HG) med proinflammatoriske cytokiner (Cyt), interleukin-1β (IL-1β) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), et kultiverende miljø som har vist seg å etterligne diabetisk retinopati (DR) i både celle- og dyresykdomsmodeller13,14,15. Luminex-analyser ble brukt i DR-modellen for å måle cytokiner som slippes ut i kulturmediet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

Tidligere humane organotypiske retinal kultur (HORC) modeller har brukt frittliggende netthinner; Men uten strukturell støtte gitt av retinal pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera, kan integriteten til den skjøre netthinnen lett bli kompromittert. Målet med denne studien var å utvikle en ny HORC-modell som inneholder netthinnen, RPE-choroiden og sclera for å opprettholde netthinneintegritet når man dyrker retinal explants.
Etter å ha kuttet omkrets langs limbussen for å fjerne iris og linse, ble det laget fire dype snitt for å flate ut øyemusken. I motsetning til tidligere HORC-protokoller ble en trefin brukt til å skjære gjennom ikke bare netthinnen, men også RPE-choroid og sclera. De resulterende trelags explants ble dyrket i 72 timer. Hematoksylin og Eosinfarging (H&E) ble brukt til å vurdere anatomiske strukturer og retinal explants ble ytterligere preget av immunhiistokjemi (IHC) for apoptose, Müller celleintegritet og retinal betennelse. For å bekrefte muligheten for sykdomsinduksjon ble explants utsatt for høy glukose (HG) og proinflammatoriske cytokiner (Cyt), for å etterligne diabetisk retinopati (DR). Luminex magnetiske perleanalyse ble brukt til å måle DR-relaterte cytokiner som slippes ut i kulturmediet.
H&E-farging avdekket distinkte retinal lameller og kompakte kjerner i retinal explants med underliggende RPE-choroid og sclera, mens netthinner uten underliggende strukturer viste redusert tykkelse og alvorlig nuklei tap. IHC-resultatene indikerte fravær av apoptose og retinal betennelse samt bevart Müller celleintegritet. Luminex-analysene viste signifikant økt sekresjon av DR-assosierte proinflammatoriske cytokiner i retinal explants eksponert for HG + Cyt i forhold til baseline nivåer ved 24 timer.
Vi utviklet og karakteriserte en ny HORC-protokoll der netthinneintegritet ble bevart uten apoptose eller retinal betennelse. Videre antyder den induserte sekresjonen av DR-assosierte proinflammatoriske biomarkører når de utsetter retinal explants til HG + Cyt at denne modellen kan brukes til klinisk overførbare retinal sykdomsstudier.

Netthinneintegritet ble bevart i denne HORC-modellen. Retinal integritet ble bevart i de kultiverte sandwich retinal explants, men gikk tapt i netthinnen dyrket uten tilstøtende strukturer. H&E ble gjennomført for å undersøke den strukturelle integriteten til seksjonerte sandwich retinal explants etter 72 timer i kultur. Sandwich retinal explants viste bevart integritet og en distinkt lamellstruktur fra GCL til ONL med kompakte kjerner i INL og ONL (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Denne studien tar sikte på å utvikle en ny human organotypisk retinal kultur (HORC) modell som forhindrer kompromitterende retinal integritet under explant håndtering. Dette oppnås ved å dyrke netthinnen med det overliggende glasslegemet og det underliggende netthinnen pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera.

Karakterisering av en ny human organotypisk retinal kulturteknikk

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Denne teknikken bevarer alle retinal lag og celletyper in situ, noe som gjør det mer klinisk relevant sammenlignet med dyr og in vitro modeller. Den største fordelen med denne protokollen er at den minimerer retinal integritetsforstyrrelse under vevshåndtering, noe som er viktig når man sammenligner sunn og syk netthinne. Netthinnesykdommer kan etterlignes ved å dyrke vevet under bestemte forhold.Dette gjør det mulig å teste nye legemiddelbehandlinger. Disseksjons- og prøveinnsamlingsprosedyrene er komplekse. Derfor er visuell demonstrasjon avgjørende for å hjelpe leserne med å forstå den skriftlige protokollen og utføre prosedyren vellykket.Charisse Kuo, en andreårs ph.d.-student fra laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren. Forbered kulturmediet som inneholder Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 og en gang antibiotika og antimykotikkblanding. Først legger du 500 mikroliter medium i en 24-brønns plate og likevekter den i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Å ha media klar før explant utvinning unngår dislodging av netthinnen ved senere tillegg. For å trekke ut retinal explants, begynn med å plassere øyemusken på en Petri-tallerken med iris og linse vendt oppover og ONH som kommer i kontakt med Petri-parabolen. Hold øyeklokken stødig ved limbussen ved hjelp av tang og løsne iris og linse ved å gjøre små kutt omkrets langs ytterkanten av limbussen.Fjern iris og linse nøye, sørg for å unngå å forstyrre netthinnen. Identifiser ONH ved hjelp av en lys hvit lyskilde og hell ved de fire kvadrantene mot ONH som roterer Petri-parabolen for enklere håndtering. Spred og flat øyemusken forsiktig.Påfør tangene på scleraen i stedet for netthinnen for å unngå å forstyrre netthinnens integritet. Fjern platen som inneholder det forberedte mediet fra inkubatoren. Plasser en kirurgisk trefin på netthinnen i en region uten netthinnefolder og trykk hardt for å trenge inn i scleraen, noe som skal generere en sprekklyd når du bryter gjennom Petri-parabolen.Roter trefinen for å sikre at scleraen er penetrert fullt ut slik at retinal explant nå er skilt fra resten av prøven. Påfør tangene på scleraen og overfør sandwich retinal explant til kulturmediet. Kultur de innsamlede sandwich retinal explants ved 37 grader Celsius i opptil 72 timer i en fuktet 5% karbondioksid inkubator.Hematoksylin og eosinfarging viste at sandwich retinal explants bevart integritet og en distinkt lamellstruktur fra GCL til ONL med kompakte kjerner i de indre og ytre kjernefysiske lagene. Forstyrret retinal integritet ble funnet på kantene av samme prøve der netthinnen hadde løsnet fra den underliggende RPE choroid og sclera viser redusert retinal tykkelse og tap av kjerner i INL og ONL. Ingen TUNEL-positive cellekjerner, som markerer cellulær apoptose, ble funnet i retinal explants dyrket under basale forhold, noe som demonstrerer vedvarende cellulær vitalitet selv etter 72 timer.GFAP-merking var begrenset til GCL og IPL uten glial fibrose, et tegn på patologi som ville bli identifisert som utvidet uttrykk for GFAP i ONL. Vimentin ble sterkt uttrykt fra ganglioncellelaget til det ytre kjernefysiske laget, og viste bevart Mueller celleintegritet sett i normalt netthinnevev. Luminex magnetisk analyse viste at IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 nivåer økte betydelig over baseline i sandwich retinal explant kulturer i høy glukose og proinflammatoriske cytokiner etter 24 timer.Etter 72 timer var IL-18- og VEGF-nivåene betydelig høyere, men det ble ikke funnet noen signifikant forskjell i IL-6- og IL-8-nivå. Når du utfører denne prosedyren, la tilstrekkelig gjenværende glasslegeme, som vil veie netthinnen ned slik at den ikke løsner fra RP-koroiden og flyter i kulturmediene. Den kultiverte netthinnen kan ytterligere karakteriseres ved hjelp av immunhiistokjemi og histologi, mens de inflammatoriske cytokinene som slippes ut i det dyrkede mediet, kan måles ved hjelp av en Luminex magnetisk analyse.Denne modellen er mer klinisk oversettbar sammenlignet med dyre- og in vitro-modeller, noe som gjør mer egnet for å teste effekten av nye terapeutiske legemidler for netthinnesykdommer.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Rescue Technique for Difficult Intubation and Difficult Ventilation

We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

A Novel Capsulorhexis Technique Using Shearing Forces with Cystotome

Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

En forenklet Teknikk for<em&gt; In situ</em&gt; Eksisjon av hornhinnen og Evisceration av Retinal vev fra Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Behandling av humant Reduksjon mammoplasty og mastektomi Vev for Cell Culture

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En organotypiske høy gjennomstrømning System for Karakterisering av Drug Sensitivity of Primary myelomatose Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

En hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur System for Studerer svulstens mikromiljø og målrettet Drug terapier

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

Modellere Tidlig Steps for eggstokkreft Formidling i en organotypiske Culture of Human bukhulen

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivekulturmodell for studier av tumorcellemigrasjon og pasientspesifikke effekter av antiinvasjonsmidler

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

En detaljert protokoll for Svette Monitoring Ved hjelp av en roman, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...