Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
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Os autores gostariam de agradecer aos generosos doadores de tecidos oculares e à equipe do Banco Nacional de Olhos da Nova Zelândia pelo apoio. Este trabalho foi apoiado financeiramente por subvenções do projeto do Maurice and Phyllis Paykel Trust e da Auckland Medical Research Foundation (1117015). A direção da IDR é apoiada pela Fundação de Caridade Buchanan. A bolsa de estudos da CK é fornecida pela Associação neozelandesa de Fundos de Pesquisa e Educação de Optometristas (CC36812) e a bolsa de estudos da HHL é fornecida pela Fundação de Caridade Buchanan.

Os copos oculares de doadores humanos foram obtidos do Banco Nacional de Olhos da Nova Zelândia após a excisão da córnea para transplante e aprovados pelo Comitê de Ética em Saúde e Deficiência do Norte B (NTX/06/19/CPD/AM07).
NOTA: A cultura deve ser feita em um armário de biossegurança classe II para garantir condições de cultura de tecido estéril. Os tecidos devem ser cultivados dentro de 24 horas após a morte para evitar perda significativa de integridade da retina.
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	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. 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C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. 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D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. 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H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC é atualmente o modelo mais clinicamente traduzível em pesquisas pré-clínicas de retina. Em comparação com modelos de cultura celular in vitro, o HORC pode representar melhor a anatomia da retina humana in situ, através da retenção dos tipos dinâmicos de células da retina e suas conexões com neurônios, vasculaturas e o ambiente extracelular19. Em comparação com os modelos animais, o HORC é mais vantajoso no estudo da fisiopatologia e na concepção de tratamentos farmacêuticos...

A retina é uma estrutura ocular altamente especializada responsável por transformar energia leve de entrada em sinais elétricos, que são então processados pelo cérebro para percepção visual. A retina humana contém uma gama dinâmica de tipos celulares, altamente organizada em uma estrutura lamelar única composta por duas camadas sinápticas e três núcleos1 (Figura 1). A homeostase da retina é sustentada pelas intrincadas conexões entre células neuroretinais, vasos sanguíneos, nervos, tecidos conjuntivos e o RPE1. Devido à sofisticada anatomia e fisiologia da retina, os mecanismos de muitas doenças da retina ainda permanecem mal compreendidos2,3,4,5. Para melhor estudar as doenças da retina, foram desenvolvidos modelos HORC6,7,8,9. Em comparação com estudos em animais e culturas in vitro, os modelos HORC são vantajosos porque mantêm o ambiente celular dinâmico e interações neurovasculares complexas in situ, proporcionando um bom modelo para tradução clínica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Figura 1: Estruturas oculares posteriores do olho humano. Anterior a posterior, as camadas de retina são: camada de fibra nervosa (NFL), camada de célula de glion (GCL), camada plexiforme interna (IPL), camada nuclear interna (INL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear externa (ONL), segmento interno do fotoreceptor (IS) e camada externa fotorreceptora (OS). As células dentro da retina incluem células de gânglio (azul), células amacrinas (amarelas), células bipolares (vermelhas), células horizontais (roxas), fotorreceptores de vara (rosa) e fotorreceptores de cone (verde). O vítreo está localizado anterior à retina. O RPE, a membrana de Bruch, coroide e esclera estão localizados posteriormente à retina. Observe que a imagem mostrada é apenas uma representação esquemática da retina e a razão de conectividade celular/retina dentro de cada camada pode não ser indicativa do cenário in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os protocolos HORC anteriormente caracterizados6,7,8,9 envolveram a separação da retina do RPE-coroide e esclera subjacentes utilizando uma trefina cirúrgica. No entanto, sem o suporte fornecido por essas estruturas subjacentes, a retina translúcida torna-se frágil, difícil de manusear e ferramentas como fórceps podem facilmente interromper sua integridade. Além disso, isolar a retina na cultura sem o RPE tem sido demonstrada como causa de apoptose de células gânglios e degeneração fotorreceptora10,11,12. Assim, um protocolo HORC alternativo que minimize a perda da integridade da retina e imite melhor o ambiente in vivo seria útil. Isso é particularmente importante ao estudar mecanismos de doenças da retina, pois lesões físicas durante o manuseio de explant podem introduzir artefatos. Por isso, o objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo HORC que inclua o RPE-choroid e a esclera, a fim de proteger a integridade da retina durante o manuseio e cultura da explant.
Para atingir esse objetivo, foram extraídas explanações de retina "sanduíche" entre o vítreo residual e o RPE-coroide e esclera subjacentes. Nas explantas do sanduíche, o vítreo pesa para baixo da retina para evitar o descolamento e a dobra da retina, enquanto a esclera resistente e fibrosa atua tanto como um andaime para suporte estrutural quanto um ponto de contato para fórceps. Além disso, modelos animais têm demonstrado que a retenção do RPE na cultura pode prevenir a degeneração da retina e a proliferação gliana, uma resposta das células de Müller a sinais de perigo como hipóxia e inflamação10,11,12.
Para caracterizar o modelo, foram realizadas explanações de retina sanduíche com Hemaoxilalina e Eosina (H&E) para avaliar estruturas anatômicas e imunohistoquímica (IHC), rotulagem explants com terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL, um marcador de célula apoptótica), proteína ácida fibrilar gliana (GFAP, uma inflamação da retina e marcador de ativação celular Müller), e vimentina, um marcador de integridade celular Müller. Para determinar se esse modelo pode ser induzido a desenvolver sinais de doença molecular, as explantas foram expostas à alta glicose (HG) com citocinas pró-inflamatórias (Cyt), interleucina-1β (IL-1β) e fator-α tumoral (TNF-α), ambiente de cultivo que tem sido mostrado para imitar a retinopatia diabética (DR) nos modelos de doenças celulares e animais13,14,15. Os ensaios luminex foram utilizados no modelo DR para medir citocinas liberadas no meio da cultura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

Modelos anteriores de cultura de retina organotípica humana (HORC) utilizaram retinas descoladas; no entanto, sem o suporte estrutural conferido pelo pigmento da retina epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera, a integridade da frágil retina pode ser facilmente comprometida. O objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo HORC que contenha a retina, RPE-choroid e esclera para manter a integridade da retina ao esculpir explants da retina.
Depois de cortar circunferencialmente ao longo do limbus para remover íris e lente, quatro incisões profundas foram feitas para achatar a xícara ocular. Em contraste com os protocolos HORC anteriores, uma trefina foi usada para cortar não apenas a retina, mas também o RPE-coroid e esclera. As explantas de três camadas resultantes foram cultivadas por 72 h. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi utilizada para avaliar estruturas anatômicas e as explanações da retina foram ainda caracterizadas pela imunohistoquímica (IHC) para apoptose, integridade celular de Müller e inflamação da retina. Para confirmar a possibilidade de indução da doença, explantas foram expostas a citocinas pró-inflamatórias (Cyt), para imitar a retinopatia diabética (DR). O ensaio de contas magnéticas Luminex foi usado para medir citocinas relacionadas à DR liberadas no meio da cultura.
A coloração de H&E revelou lamellae de retina distinta e núcleos compactos em explantas de retina com o RPE-coroide e esclera subjacentes, enquanto as retinas sem as estruturas subjacentes apresentaram espessura reduzida e perda severa de núcleos. Os resultados do IHC indicaram ausência de apoptose e inflamação da retina, bem como a integridade celular de Müller preservada. Os ensaios luminex mostraram significativamente aumentado a secreção de citocinas pró-inflamatórias associadas à DR em explantas de retina expostas a HG + Cyt em relação aos níveis de linha de base a 24 h.
Desenvolvemos e caracterizamos com sucesso um novo protocolo HORC no qual a integridade da retina foi preservada sem apoptose ou inflamação da retina. Além disso, a secreção induzida de biomarcadores pró-inflamatórios associados à DR ao expor explantas de retina ao HG + Cyt sugere que este modelo poderia ser usado para estudos clinicamente traduzíveis da doença da retina.

A integridade da retina foi preservada neste modelo HORC. A integridade da retina foi preservada nas explantas de retina de sanduíches cultivados, mas foi perdida na retina cultivada sem estruturas adjacentes. A H&E foi conduzida para examinar a integridade estrutural das explantas de retina de sanduíche seccionada após 72 h na cultura. As explantas de retina do sanduíche mostraram integridade preservada e uma estrutura lamellae distinta de GCL a ONL com núcleos com...

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Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo modelo de cultura de retina organotípica humana (HORC) que previne comprometer a integridade da retina durante o manuseio da explant. Isso é conseguido através da cultura da retina com o vítreo sobrelada e o pigmento de retina subjacente epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera.

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Esta técnica preserva todas as camadas de retina e tipos de células in situ, tornando-a mais clinicamente relevante em comparação com modelos animais e in vitro. A principal vantagem deste protocolo é que ele minimiza a interrupção da integridade da retina durante o manuseio do tecido, o que é essencial na comparação da retina saudável e doente. Doenças da retina podem ser imitadas por cultura do tecido em condições específicas.Isso permite testar novas terapias medicamentosas. Os procedimentos de dissecção e coleta de amostras são complexos. Portanto, a demonstração visual é fundamental para ajudar os leitores a entender o protocolo escrito e conduzir o procedimento com sucesso.Demonstrando o procedimento estará Charisse Kuo, aluna do segundo ano de doutorado do meu laboratório. Prepare o meio de cultura contendo a mistura de médio/nutriente modificado da Águia Modificada de Dulbecco F-12 e uma mistura de antibióticos e antimícticos uma vez. Primeiro, coloque 500 microliters de médio em uma placa de 24 poços e equilibre-o em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Ter a mídia pronta antes da extração de explant evita o desalojar da retina após a adição subsequente. Para extrair explanações de retina, comece colocando a xícara ocular em uma placa de Petri com a íris e a lente voltadas para cima e o ONH entrando em contato com a placa de Petri. Segure a xícara ocular firme no limbus usando fórceps e desprende a íris e a lente fazendo pequenos cortes circunferencialmente ao longo da borda externa do limbus.Remova a íris e a lente cuidadosamente, certificando-se de evitar perturbar a retina. Identifique o ONH usando uma fonte de luz branca brilhante e inciso nos quatro quadrantes em direção ao ONH girando a placa de Petri para facilitar o manuseio. Espalhe e achate a opaia cuidadosamente.Aplique as fórceps na esclera em vez da retina para evitar interromper a integridade da retina. Remova a placa que contém a mídia preparada da incubadora. Coloque uma trefina cirúrgica na retina em uma região sem dobras de retina e pressione fortemente para penetrar a esclera, o que deve gerar um som de rachaduras à medida que você rompe a placa de Petri.Gire a trefina para garantir que a esclera tenha sido penetrada totalmente de tal forma que a explanta da retina esteja agora separada do resto da amostra. Aplique as fórceps na esclera e transfira a explanta de retina sanduíche para o meio de cultura. Cultura o sanduíche coletado explanta retina a 37 graus Celsius por até 72 horas em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.A hematoxilina e a coloração de eosina mostraram que as explanações de retina do sanduíche preservavam a integridade e uma estrutura lamellae distinta do GCL ao ONL com núcleos compactos nas camadas nucleares internas e externas. A integridade da retina interrompida foi encontrada nas bordas da mesma amostra onde a retina se desprendeu do coroide e esclera rpe subjacente mostrando redução da espessura da retina e perda de núcleos no INL e ONL. Nenhum núcleo celular tunel positivo, que marca a apoptose celular, foram encontrados em explanações de retina cultivadas em condições basais, demonstrando vitalidade celular sustentada mesmo após 72 horas.A rotulagem GFAP foi restrita à GCL e ao IPL sem fibrose gliana, um sinal de patologia que seria identificada como expressão estendida de GFAP no ONL. Vimentina foi altamente expressa da camada de células gânglios para a camada nuclear externa, mostrando a integridade celular de Mueller preservada como visto em tecidos normais da retina. O ensaio magnético luminex mostrou que os níveis IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaram significativamente acima da linha de base nas culturas de explante de retina sanduíche em alta glicose e citocinas pró-inflamatórias após 24 horas.Após 72 horas, os níveis IL-18 e VEGF permaneceram significativamente aumentados, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nos níveis IL-6 e IL-8. Ao realizar este procedimento, deixe o suficiente de vítreo residual suficiente, que pesará a retina para baixo para que não se desprende do RP choroide e flutue na mídia cultural. A retina cultivada pode ser ainda caracterizada usando imunestoquímica e histologia, enquanto as citocinas inflamatórias liberadas no meio cultivado podem ser medidas usando um ensaio magnético Luminex.Este modelo é mais clinicamente traduzível em comparação com modelos animais e in vitro, o que torna mais adequado para testar a eficácia de novos fármacos terapêuticos para doenças da retina.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Rescue Technique for Difficult Intubation and Difficult Ventilation

A Técnica de Resgate Novel para intubação difícil e Ventilação Difícil

We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

Medicina

A Novel Capsulorhexis Technique Using Shearing Forces with Cystotome

A Técnica Capsulorhexis Novel Usando as forças de cisalhamento com Cystotome

Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

Uma nova técnica de Capsulorhexis Resgatando Radial Rasgue-out usando um Cystotome

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

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An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

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Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

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Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

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Um protocolo detalhado para Monitoramento transpiração Usando um Novel, Pequeno, dispositivo sem fios

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