Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
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Los autores desean agradecer a los generosos donantes de tejidos oculares y al equipo del Banco Nacional de Ojos de Nueva Zelanda por su apoyo. Este trabajo fue apoyado financieramente por subvenciones para proyectos del Maurice and Phyllis Paykel Trust y la Auckland Medical Research Foundation (1117015). La dirección de IDR cuenta con el apoyo de la Buchanan Charitable Foundation. La beca de CK es proporcionada por el Fondo de Educación e Investigación de la Asociación de Optometristas de Nueva Zelanda (CC36812) y la beca de HHL es proporcionada por la Fundación Caritativa Buchanan.

Las copas de ojos de donantes humanos se obtuvieron del Banco Nacional de Ojos de Nueva Zelanda después de la escisión corneal para trasplante y según lo aprobado por el Comité de Ética de Salud y Discapacidad de Northern B (NTX/06/19/CPD/AM07).
NOTA: El cultivo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad de Clase II para garantizar condiciones de cultivo de tejidos estériles. Los tejidos deben cultivarse dentro de las 24 h post mortem para evitar una pérdida significativa de la inte...

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	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan.">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li><li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy.">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li><li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+(HORFC)+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11.">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina.">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li><li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. 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C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. 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D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice:+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy.">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).</li><li>. R&amp;D Systems, I Available from: <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020)</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li><li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">M&#252;ller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li><li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+explant+culture:+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina.">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li><li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta,+IL-6,+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy.">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li><li>Lee, J. -. 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H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC es actualmente el modelo clínicamente más traducible en la investigación preclínica de la retina. En comparación con los modelos de cultivo celular in vitro, HORC puede representar mejor la anatomía de la retina humana in situ, a través de la retención de los tipos dinámicos de células retinianas y sus conexiones con las neuronas, las vasculaturas y el entorno extracelular19. En comparación con los modelos animales, los HORC son más ventajosos en el estudio de la fisiopatología y...

La retina es una estructura ocular altamente especializada responsable de transformar la energía de la luz entrante en señales eléctricas, que luego son procesadas por el cerebro para la percepción visual. La retina humana contiene un rango dinámico de tipos de células, altamente organizadas en una estructura lamelar única que consiste en dos capas sinápticas y tres núcleos1 (Figura 1). La homeostasis retiniana se sustenta en las intrincadas conexiones entre las células neurorretinianas, los vasos sanguíneos, los nervios, los tejidos conectivos y el RPE1. Debido a la sofisticada anatomía y fisiología de la retina, los mecanismos de muchas enfermedades de la retina siguen siendo poco conocidos2,3,4,5. Para estudiar mejor las enfermedades de la retina, se han desarrollado modelos HORC6,7,8,9. En comparación con los estudios en animales y los cultivos in vitro, los modelos HORC son ventajosos porque conservan el entorno celular dinámico y las interacciones neurovasculares complejas in situ, proporcionando un buen modelo para la traducción clínica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Figura 1: Estructuras oculares posteriores del ojo humano. De anterior a posterior, las capas de la retina son: capa de fibra nerviosa (NFL), capa de células ganglionares (GCL), capa plexiforme interna (IPL), capa nuclear interna (INL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear externa (ONL), segmento interno del fotorreceptor (IS) y capa externa (SO) del fotorreceptor. Las células dentro de la retina incluyen células ganglionares (azul), células amacrinas (amarillas), células bipolares (rojas), células horizontales (púrpura), fotorreceptores de bastón (rosa) y fotorreceptores de cono (verde). El vítreo se localiza antes de la retina. El RPE, la membrana de Bruch, la coroides y la esclerótica se encuentran posteriores a la retina. Tenga en cuenta que la imagen que se muestra es solo una representación esquemática de la retina y la relación entre las células y la conectividad retiniana dentro de cada capa puede no ser indicativa de la configuración in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los protocolos HORC previamente caracterizados6,7,8,9 han implicado separar la retina de la RPE-coroides subyacente y la esclerótica mediante una trefina quirúrgica. Sin embargo, sin el apoyo proporcionado por estas estructuras subyacentes, la retina translúcida se vuelve endeble, difícil de manejar y herramientas como los fórceps pueden interrumpir fácilmente su integridad. Además, se ha demostrado que el aislamiento de retina en cultivo sin el RPE causa apoptosis de células ganglionares y degeneración fotorreceptora10,11,12. Por lo tanto, sería útil un protocolo HORC alternativo que minimice la pérdida de integridad de la retina e imite mejor el entorno in vivo. Esto es particularmente importante cuando se estudian los mecanismos de la enfermedad de la retina, ya que la lesión física durante el manejo del explante podría introducir artefactos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que incluya la RPE-coroides y la esclerótica para proteger la integridad de la retina durante el manejo y cultivo del explante.
Para lograr este objetivo, se extrajeron explantes de retina "intercalados" entre el vítreo residual y la coroides y esclerótica subyacentes. En los explantes sándwich, el vítreo pesa sobre la retina para evitar el desprendimiento y plegamiento de la retina, mientras que la esclerótica fibrosa y resistente actúa como un andamio para el soporte estructural y un punto de contacto para los pórceps. Por otra parte, modelos animales han demostrado que retener el RPE en cultivo puede prevenir la degeneración retiniana y la proliferación glial, una respuesta de las células de Müller a señales de peligro como la hipoxia y la inflamación10,11,12.
Para caracterizar el modelo, se tiñeron explantes retinianas sándwich con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar las estructuras anatómicas y se realizó inmunohistoquímica (IHC), marcando explantes con desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick end labeling (TUNEL, un marcador de células apoptóticas), proteína ácida fibrilar glial (GFAP, una inflamación retiniana y marcador de activación celular de Müller) y vimentina, un marcador de integridad celular de Müller. Para determinar si este modelo puede ser inducido a desarrollar signos moleculares de enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) con citoquinas proinflamatorias (Cyt), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), un ambiente de cultivo que se ha demostrado que imita la retinopatía diabética (DR) tanto en modelos de enfermedades celulares como animales13,14,15. Los ensayos de Luminex se utilizaron en el modelo DR para medir las citoquinas liberadas en el medio de cultivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

Los modelos previos de cultivo organotípico de retina (HORC) humano han utilizado retinas desprendidas; sin embargo, sin el soporte estructural conferido por el epitelio-coroide pigmentario de la retina (EPR-coroides) y la esclerótica, la integridad de la retina frágil puede verse fácilmente comprometida. El objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que contenga la retina, la CORoides RPE y la esclerótica para mantener la integridad de la retina al cultivar explantes retinianas.
Después de cortar circunferencialmente a lo largo del limbo para eliminar el iris y el cristalino, se hicieron cuatro incisiones profundas para aplanar el ocular. A diferencia de los protocolos HORC anteriores, se utilizó una trefina para cortar no solo la retina, sino también la COROIDES y la esclerótica. Los explantes de triple capa resultantes se cultivaron durante 72 h. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizó para evaluar las estructuras anatómicas y los explantes retinianas se caracterizaron además por inmunohistoquímica (IHC) para la apoptosis, la integridad de las células de Müller y la inflamación de la retina. Para confirmar la posibilidad de inducción de la enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) y citoquinas proinflamatorias (Cyt), para imitar la retinopatía diabética (RD). El ensayo de perla magnética de Luminex se utilizó para medir las citoquinas relacionadas con DR liberadas en el medio de cultivo.
La tinción de H&E reveló distintas láminas retinianas y núcleos compactos en explantes retinianas con la coroides y la esclerótica subyacentes, mientras que las retinas sin las estructuras subyacentes exhibieron un grosor reducido y una pérdida severa de núcleos. Los resultados de la IHC indicaron la ausencia de apoptosis e inflamación de la retina, así como la preservación de la integridad de las células de Müller. Los ensayos de Luminex mostraron un aumento significativo de la secreción de citoquinas proinflamatorias asociadas a DR en explantes retinianas expuestos a HG + Cyt en relación con los niveles basales a las 24 h.
Desarrollamos y caracterizamos con éxito un nuevo protocolo HORC en el que se preservó la integridad de la retina sin apoptosis ni inflamación de la retina. Además, la secreción inducida de biomarcadores proinflamatorios asociados a la RD al exponer los explantes de retina a HG + Cyt sugiere que este modelo podría usarse para estudios de enfermedad de la retina clínicamente traducibles.

La integridad de la retina se conservó en este modelo HORC. La integridad retiniana se conservó en los explantes retinianas sándwich cultivados, pero se perdió en la retina cultivada sin estructuras adyacentes. H&E se llevó a cabo para examinar la integridad estructural de los explantes retiniana sándwich seccionados después de 72 h en cultivo. Los explantes retinianas sándwich mostraron integridad preservada y una estructura de láminas distinta de GCL a ONL con ...

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Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.

Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Esta técnica preserva todas las capas de retina y los tipos de células in situ, lo que la hace clínicamente más relevante en comparación con los modelos animales e in vitro. La principal ventaja de este protocolo es que minimiza la interrupción de la integridad de la retina durante el manejo de los tejidos, lo cual es esencial cuando se compara retina sana y enferma. Las enfermedades de la retina se pueden imitar cultivando el tejido en condiciones específicas.Esto permite probar nuevas terapias farmacológicas. Los procedimientos de disección y recolección de muestras son complejos. Por lo tanto, la demostración visual es fundamental para ayudar a los lectores a comprender el protocolo escrito y llevar a cabo el procedimiento con éxito.Demostrando el procedimiento estará Charisse Kuo, una estudiante de doctorado de segundo año de mi laboratorio. Prepare el medio de cultivo que contenga la mezcla F-12 de medio/nutriente Modified Eagle de Dulbecco y una mezcla de antibióticos y antimicóticos una vez. Primero, coloque 500 microlitros de medio en una placa de 24 pozos y equilibre en una incubadora humidificada a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.Tener el medio listo antes de la extracción del explante evita el desalojo de la retina tras la posterior adición. Para extraer explantes de retina, comience colocando el ocular en una placa de Petri con el iris y la lente hacia arriba y el ONH en contacto con la placa de Petri. Mantenga el ocular firme en el limbo con confórceps y separe el iris y el cristalino haciendo pequeños cortes circunferenciales a lo largo del borde externo del limbo.Retire el iris y la lente con cuidado, asegurándose de evitar perturbar la retina. Identifique el ONH utilizando una fuente de luz blanca brillante e incise en los cuatro cuadrantes hacia el ONH girando la placa de Petri para facilitar su manejo. Extienda y aplane el ocular con cuidado.Aplique los pórceps a la esclerótica en lugar de a la retina para evitar interrumpir la integridad de la retina. Retire la placa que contiene el medio preparado de la incubadora. Coloque una trefina quirúrgica en la retina en una región sin pliegues retinianas y presione con fuerza para penetrar la esclerótica, lo que debería generar un sonido de agrietamiento a medida que atraviesa la placa de Petri.Gire la trefina para asegurarse de que la esclerótica ha sido penetrada completamente de tal manera que el explante de retina ahora está separado del resto de la muestra. Aplique los forrórceps en la esclerótica y transfiera el explante retiniana sándwich al medio de cultivo. Culta los explantes de retina sándwich recolectados a 37 grados centígrados durante un total de 72 horas en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%.La tinción de hematoxilina y eosina mostró que los explantes retinianas sándwich preservaron la integridad y una estructura de láminas distinta desde el GCL hasta el ONL con núcleos compactos en las capas nucleares internas y externas. Se encontró integridad retiniana alterada en los bordes de la misma muestra donde la retina se había desprendido de la coroides y la esclerótica subyacentes de RPE mostrando un grosor retiniana reducido y pérdida de núcleos en el INL y ONL. No se encontraron núcleos celulares TUNEL positivos, que marcan la apoptosis celular, en explantes retinianas cultivados en condiciones basales, demostrando una vitalidad celular sostenida incluso después de 72 horas.El etiquetado GFAP se restringió al GCL y al IPL sin fibrosis glial, un signo de patología que se identificaría como la expresión extendida de GFAP en el ONL. La vimentina se expresó altamente desde la capa celular ganglionar hasta la capa nuclear externa, mostrando la integridad de la célula Mueller preservada como se ve en los tejidos normales de la retina. El ensayo magnético luminex mostró que los niveles de IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaron significativamente por encima del valor basal en los cultivos de explante retiniana sándwich en citoquinas proinflamatorias y de glucosa alta después de 24 horas.Después de 72 horas, los niveles de IL-18 y VEGF permanecieron significativamente aumentados, pero no se encontraron diferencias significativas en los niveles de IL-6 e IL-8. Al realizar este procedimiento, deje suficiente vítreo residual, que pesará la retina hacia abajo para que no se desprenda de la coroides RP y flote en el medio de cultivo. La retina cultivada se puede caracterizar aún más mediante inmunohistoquímica e histología, mientras que las citoquinas inflamatorias liberadas en el medio cultivado se pueden medir mediante un ensayo magnético Luminex.Este modelo es más traducible clínicamente en comparación con los modelos animales e in vitro, lo que lo hace más adecuado para probar la eficacia de nuevos fármacos terapéuticos para las enfermedades de la retina.

Research

JoVE Journal

Medicine

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We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

Investigación

Medicina

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Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

Una nueva técnica de capsulorrexis rescate radial de arranque a utilizar un cistítomo

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

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Una técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; La escisión de la Córnea y la evisceración del tejido de la retina del globo ocular humano

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

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