Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Författarna vill tacka de generösa donatorerna av ögonvävnader och teamet från New Zealand National Eye Bank för deras stöd. Detta arbete stöddes ekonomiskt av projektbidrag från Maurice och Phyllis Paykel Trust och Auckland Medical Research Foundation (1117015). IDR:s styrelseuppdrag stöds av Buchanan Charitable Foundation. CK:s stipendium ges av New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) och HHL:s stipendium ges av Buchanan Charitable Foundation.

Mänskliga donator ögonkoppar erhölls från Nya Zeeland National Eye Bank efter hornhinnans excision för transplantation och som godkänts av Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
OBS: Kulturen bör göras i ett biosäkerhetsskåp av klass II för att säkerställa sterila vävnadskulturförhållanden. Vävnaderna måste odlas inom 24 timmar efter slakt för att undvika betydande retinal integritet förlust.
<img alt="Figure 2" c...

<ol>
	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan.">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li><li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy.">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li><li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+(HORFC)+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11.">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina.">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li><li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+to+study+retinal+neurodegeneration.">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li><li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium.">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li><li>Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro.">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li><li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice:+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy.">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).</li><li>. R&amp;D Systems, I Available from: <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020)</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li><li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">M&#252;ller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li><li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+explant+culture:+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina.">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li><li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta,+IL-6,+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy.">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li><li>Lee, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy.">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li><li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy.">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li><li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+interleukin+12+(IL-12),+interferon-inducible+protein+10+(IP-10)+and+Interleukin+18+(IL-18)+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy.">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li><li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy.">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li><li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC är för närvarande den mest kliniskt översättbara modellen inom preklinisk näthinneforskning. Jämfört med in vitro-cellkulturmodeller kan HORC bättre representera anatomin hos den mänskliga näthinnan på plats, genom att behålla de dynamiska näthinnecelltyperna och deras kopplingar till nervceller, vaskulaturer och den extracellulära miljön19. Jämfört med djurmodeller är HORC mer fördelaktiga när det gäller att studera patofysiologin hos och utforma läkemedelsbehandlingar...

Näthinnan är en högspecialiserad okulär struktur som ansvarar för att omvandla inkommande ljusenergi till elektriska signaler, som sedan bearbetas av hjärnan för visuell uppfattning. Den mänskliga näthinnan innehåller ett dynamiskt område av celltyper, mycket organiserade i en unik lamellstruktur bestående av två synaptiska och tre atomkärnor1 (figur 1). Retinal homeostas upprätthålls av de invecklade kopplingarna mellan neuroretinal celler, blodkärl, nerver, bindväv och RPE1. På grund av den sofistikerade näthinnans anatomi och fysiologi förblir mekanismerna för många näthinnesjukdomar fortfarande dåligtförstådda 2,3,4,5. För att bättre studera näthinnesjukdomar har HORC-modeller utvecklats6,7,8,9. Jämfört med djurstudier och in vitro-kulturer är HORC-modeller fördelaktiga eftersom de behåller den dynamiska cellulära miljön och komplexa neurovaskulära interaktioner på plats, vilket ger en bra modell för klinisk översättning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Figur 1: Bakre okulära strukturer i det mänskliga ögat. Främre till bakre, näthinnan lager är: nerv fiber lager (NFL), ganglion cell lager (GCL), inre plexiform lager (IPL), inre nukleära lager (INL), yttre plexiform skikt (OPL), yttre nukleära lager (ONL), photoreceptor inre segment (IS) och photoreceptor yttre lager (OS). Celler i näthinnan inkluderar ganglionceller (blå), amacrinceller (gula), bipolära celler (röda), horisontella celler (lila), stavfotoreceptorer (rosa) och konfotoreceptorer (gröna). Glaskroppen ligger främre till näthinnan. RPE, Bruchs membran, choroid och sclera ligger posterior till näthinnan. Observera att bilden som visas endast är en schematisk representation av näthinnan och förhållandet mellan celler/näthinneanslutning inom varje lager kanske inte tyder på in vivo-inställningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Tidigare karakteriserade HORC protokoll6,7,8,9 har involverat att separera näthinnan från den underliggande RPE-choroid och sclera med hjälp av en kirurgisk trephine. Men utan stöd från dessa underliggande strukturer blir den genomskinliga näthinnan tunn, svår att hantera och verktyg som tång kan lätt störa dess integritet. Dessutom har isolerande näthinnan i kulturen utan RPE visat sig orsaka ganglion cell apoptos och fotoreceptor degeneration10,11,12. Således skulle ett alternativt HORC-protokoll som minimerar förlusten av näthinneintegritet och bättre efterliknar in vivo-miljön vara användbart. Detta är särskilt viktigt när man studerar retinal sjukdom mekanismer, som fysisk skada under explant hantering kan införa artefakter. Syftet med denna studie var därför att utveckla en ny HORC-modell som inkluderar RPE-choroid och sclera för att skydda näthinnans integritet under explanthantering och odling.
För att uppnå detta mål extraherades retinal explanter "sandwiched" mellan den återstående glaskroppen och den underliggande RPE-choroid och sclera. I smörgåsexplanterna tynger glaskroppen näthinnan för att förhindra näthinneavlossning och vikning, medan den tuffa, fibrösa skleran fungerar som både en ställning för strukturellt stöd och en kontaktpunkt för tång. Dessutom har djurmodeller visat att bibehållande av RPE i kultur kan förhindra retinal degeneration och gliaproliferation, ett svar från Müller-celler på risksignaler som hypoxi och inflammation10,11,12.
För att karakterisera modellen färgades smörgås retinal explanter med Hematoxylin och Eosin (H&E) för att bedöma anatomiska strukturer och immunohistokemi (IHC) utfördes, Märkning explanter med terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL, en apoptotisk cell markör), gliafibrillary surt protein (GFAP, en retinal inflammation och Müller cell aktivering markör) och vimentin, en markör för Müller cell integritet. För att avgöra om denna modell kan induceras för att utveckla molekylära sjukdomstecken, explanterna utsattes för hög glukos (HG) med proinflammatoriska cytokiner (Cyt), interleukin-1β (IL-1β) och tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), en odlingsmiljö som har visat sig efterlikna diabetes retinopati (DR) i både cell- och djursjukdomsmodellerna13,14,15. Luminex analyser användes i DR-modellen för att mäta cytokiner som släpptes ut i odlingsmediet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

Tidigare mänskliga organotypiska retinal kultur (HORC) modeller har använt fristående näthinnan. Men utan det strukturella stöd som ges av näthinnepigment epitel-choroid (RPE-choroid) och sclera, kan integriteten hos den bräckliga näthinnan lätt äventyras. Syftet med denna studie var att utveckla en ny HORC-modell som innehåller näthinnan, RPE-choroid och sclera för att upprätthålla näthinnans integritet vid odling av näthinneexplanter.
Efter att ha skurit omkrets längs limbus för att ta bort iris och lins, gjordes fyra djupa snitt för att platta ögonkoppen. I motsats till tidigare HORC-protokoll användes en trephine för att skära igenom inte bara näthinnan utan också RPE-choroid och sclera. De resulterande trippelskiktade explanterna odlades i 72 h. Hematoxylin och Eosin färgning (H&E) användes för att bedöma anatomiska strukturer och retinal explanter präglades ytterligare av immunohistokemi (IHC) för apoptos, Müller cell integritet och retinal inflammation. För att bekräfta möjligheten till sjukdomsinduktion utsattes explanter för hög glukos (HG) och proinflammatoriska cytokiner (Cyt), för att efterlikna diabetes retinopati (DR). Luminex magnetiska pärlanalys användes för att mäta DR-relaterade cytokiner som släpptes ut i odlingsmediet.
H&E färgning visade distinkt retinal lamellae och kompakt atomkärnor i retinal explanter med underliggande RPE-choroid och sclera, medan näthinnor utan de underliggande strukturerna uppvisade minskad tjocklek och allvarliga atomkärnor förlust. IHC resultat anges avsaknad av apoptos och retinal inflammation samt bevarade Müller cell integritet. Luminex-analyserna visade signifikant ökad utsöndring av DR-associerade proinflammatoriska cytokiner i retinala explanter som exponerades för HG + Cyt i förhållande till utgångsnivåerna vid 24 h.
Vi framgångsrikt utvecklat och karakteriserat ett nytt HORC protokoll där retinal integritet bevarades utan apoptos eller näthinneinflammation. Dessutom föreslår den inducerade utsöndring av DR-associerade proinflammatoriska biomarkörer när retinal explanter exponeras för HG + Cyt att denna modell kan användas för kliniskt översättbara retinal sjukdom studier.

Näthinneintegritet bevarades i denna HORC-modell. Retinal integritet bevarades i de odlade smörgås retinal explants men förlorades i näthinnan odlas utan angränsande strukturer. H&E genomfördes för att undersöka den strukturella integriteten hos sektionerade smörgås retinal explanter efter 72 h i kultur. Smörgås retinal explanterna visade bevarad integritet och en distinkt lamellstruktur från GCL till ONL med kompakta atomkärnor i INL och ONL (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Denna studie syftar till att utveckla en ny human organotypisk retinalkultur (HORC) modell som förhindrar att kompromissa retinal integritet under explant hantering. Detta uppnås genom att odla näthinnan med den överliggande glaskroppen och det underliggande retinalpigmentet epitel-choroid (RPE-choroid) och sclera.

Karakterisering av en ny mänsklig organotypisk retinal kulturteknik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Denna teknik bevarar alla näthinneskikt och celltyper på plats, vilket gör det mer kliniskt relevant jämfört med djur- och in vitro-modeller. Den största fördelen med detta protokoll är att det minimerar näthinneintegritetsstörning under vävnadshantering, vilket är viktigt vid jämförelse av friska och sjuka näthinna. Retinalsjukdomar kan efterliknas genom att odla vävnaden under specifika förhållanden.Detta möjliggör testning av nya läkemedelsbehandlingar. Dissekerings- och provinsamlingsförfarandena är komplexa. Därför är visuell demonstration avgörande för att hjälpa läsarna att förstå det skriftliga protokollet och genomföra proceduren framgångsrikt.Charisse Kuo, en andraårs doktorand från mitt laboratorium, visar att ingreppet kommer att visa att det blir Charisse Kuo. Förbered odlingsmediet som innehåller Dulbeccos modifierade örnmedel/ näringsblandning F-12 och en gång antibiotika och antimykotikablandning. Placera först 500 mikroliter medium i en 24-brunnsplatta och balansera den i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Att ha media redo före explant extraktion undviker att lossa näthinnan vid efterföljande tillägg. För att extrahera retinal explanter, börja med att placera ögonkoppen på en Petri-skål med iris och linsen vänd uppåt och ONH som kommer i kontakt med Petri-skålen. Håll ögonkoppen stadigt vid limbusen med tång och lossa iris och linsen genom att göra små snitt omkrets längs limbus ytterkanten.Ta försiktigt bort iris och linsen och se till att näthinnan inte störs. Identifiera ONH med hjälp av en ljus vit ljuskälla och luta dig mot de fyra kvadranterna mot ONH-vridningen petriskålen för enklare hantering. Sprid och platta till ögonkoppen försiktigt.Applicera tången på sclera istället för näthinnan för att undvika att störa näthinnans integritet. Ta bort plattan som innehåller det beredda mediet från inkubatorn. Placera en kirurgisk trephine på näthinnan i en region utan näthinneveck och tryck hårt för att tränga in i sclera, vilket bör generera ett sprakande ljud när du bryter igenom Petri-skålen.Rotera trefinen för att säkerställa att scleran har trängts in helt så att näthinnans explant nu är separerad från resten av provet. Applicera tången på sclera och överför smörgåsretinal explanten till odlingsmediet. Kultur de insamlade smörgåsretinal explanterna vid 37 grader Celsius i upp till 72 timmar i en fuktad 5%koldioxidinkubator.Hematoxylin och eosin färgning visade att smörgås retinal explanter bevarade integritet och en distinkt lamellae struktur från GCL till ONL med kompakt atomkärnor i inre och yttre nukleära lager. Störd näthinneintegritet hittades vid kanterna på samma prov där näthinnan hade lossnat från den underliggande RPE choroid och sclera visar minskad näthinnetjocklek och förlust av atomkärnor i INL och ONL. Inga TUNEL-positiva cellkärnor, som markerar cellulär apoptos, hittades i retinal explanter odlade i basala förhållanden, vilket visar ihållande cellulär vitalitet även efter 72 timmar.GFAP märkning var begränsad till GCL och IPL utan stödjebrösa fibros, ett tecken på patologi som skulle identifieras som utökade uttryck för GFAP i ONL. Vimentin uttrycktes högt från ganglion cell lager till det yttre kärnskiktet, visar bevarade Mueller cell integritet sett i normala näthinnan vävnader. Luminex magnetiska analys visade att IL-18, VEGF, IL-6 och IL-8 nivåer ökade betydligt över baslinjen i sandwich retinal explant kulturer i hög glukos och pro-inflammatoriska cytokiner efter 24 timmar.Efter 72 timmar, IL-18 och VEGF nivåer förblev betydligt ökade, men ingen betydande skillnad hittades i IL-6 och IL-8 nivåer. När du utför denna procedur, lämna tillräckligt med kvarvarande glaskropp, vilket kommer att tynga näthinnan ner så att den inte lossnar från RP-choroiden och flyter i kulturmedierna. Den odlade näthinnan kan ytterligare karakteriseras med immunohistokemi och histologi, medan de inflammatoriska cytokiner som frigörs i det odlade mediet kan mätas med hjälp av en Luminex magnetisk analys.Denna modell är mer kliniskt översättbar jämfört med djur- och in vitro-modeller, vilket gör det mer lämpligt att testa effekten av nya terapeutiska läkemedel för näthinnesjukdomar.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Rescue Technique for Difficult Intubation and Difficult Ventilation

A Novel Rescue Teknik för svåra Intubation och Svårt Ventilation

We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

A Novel Capsulorhexis Technique Using Shearing Forces with Cystotome

A Novel Capsulorhexis teknik med hjälp av skjuvkrafter med Cystotome

Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

En ny teknik att rädda Capsulorhexis Radial Tear-ut med en Cystotome

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

En förenklad Teknik för<em&gt; In situ</em&gt; Excision av hornhinna och urtagning av retinal Vävnad från Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Behandling av mänskliga Minskning mammoplasty och vävnader mastektomi för cellodling

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

En hjärntumör / Organotypiska Slice samodlingssystemet för att studera tumörens mikro och Targeted Drug terapier

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

Modellering de tidiga stegen av äggstockscancer Spridning i en Organotypic Kultur av den mänskliga Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivkulturmodell för studie av tumörcell migrering och patientspecifika effekter av antiinvasiva läkemedel

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Ett detaljerat protokoll för svett övervakning med hjälp av en roman, liten, trådlös enhet

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...