Name: characterization of a novel human organotypic retinal culture technique
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Yazarlar, destekleri için göz dokularının cömert bağışçılarına ve Yeni Zelanda Ulusal Göz Bankası ekibine teşekkür ediyor. Bu çalışma Maurice ve Phyllis Paykel Trust ve Auckland Tıbbi Araştırma Vakfı'nın (1117015) proje hibeleriyle finansal olarak desteklendi. IDR'nin direktörlüğü Buchanan Hayır Kurumu tarafından desteklenmektedir. CK'nin bursu Yeni Zelanda Optometristler Eğitim ve Araştırma Fonu Derneği (CC36812) tarafından, HHL'nin bursu ise Buchanan Hayır Kurumu tarafından sağlanmaktadır.

İnsan donör göz kapları, nakil için kornea eksizyonunu takiben ve Kuzey B Sağlık ve Engellilik Etik Komitesi (NTX/06/19/CPD/AM07) tarafından onaylandığı şekilde Yeni Zelanda Ulusal Göz Bankası'ndan elde edildi.
NOT: Steril doku kültürü koşullarını sağlamak için kültür sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Önemli retina bütünlüğü kaybını önlemek için dokular 24 saat içinde kültürlenmelidir.
<img alt="Figure 2" class=...

<ol>
	<li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina.">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).</li><li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+serous+chorioretinopathy:+an+update+on+pathogenesis+and+treatment.">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li><li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+macular+degeneration+and+drusen:+neuroinflammation+in+the+retina.">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li><li>Chen, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan.">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li><li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy.">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li><li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+(HORFC)+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11.">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina.">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li><li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+to+study+retinal+neurodegeneration.">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li><li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+retinal+cultures+(HORCs)+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration.">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li><li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture.">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium.">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li><li>Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro.">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li><li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown.">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release.">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li><li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice:+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy.">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).</li><li>. R&amp;D Systems, I Available from: <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020)</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li><li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin.">M&#252;ller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li><li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+explant+culture:+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina.">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li><li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta,+IL-6,+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy.">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li><li>Lee, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy.">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li><li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy.">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li><li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+interleukin+12+(IL-12),+interferon-inducible+protein+10+(IP-10)+and+Interleukin+18+(IL-18)+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy.">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li><li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy.">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li><li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy.">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li></ol>

HORC şu anda klinik öncesi retina araştırmalarında klinik olarak en çevrilebilir modeldir. İn vitro hücre kültürü modelleriyle karşılaştırıldığında, HORC, dinamik retina hücre tiplerini ve nöronlar, vaskülürler ve hücre dışı ortamla bağlantılarını koruyarak insan retinasının anatomisini daha iyi temsil edebilir19. Hayvan modellerine kıyasla HORC, farklı retina hücre tiplerinin yanı sıra değişen fotoreceptör yoğunluğu ve oranları gibi türler arası varya...

Retina, gelen ışık enerjisini elektrik sinyallerine dönüştürmekten sorumlu son derece özel bir oküler yapıdır ve daha sonra beyin tarafından görsel algı için işlenir. İnsan retinası, iki sinaptik ve üç çekirdek katmanı1 'den(Şekil 1)oluşan benzersiz bir lameller yapıda son derece düzenlenmiş dinamik bir hücre tipi yelpazesi içerir. Retina homeostazı nöroretinal hücreler, kan damarları, sinirler, bağ dokuları ve RPE1arasındaki karmaşık bağlantılar tarafından sürdürülür. Sofistike retina anatomisi ve fizyolojisi nedeniyle, birçok retina hastalığının mekanizmaları hala iyi anlaşılmamıştır2,3,4,5. Retina hastalıklarını daha iyi incelemek için HORC modellerigeliştirilmiştir 6,7,8,9. Hayvan çalışmaları ve in vitro kültürlerle karşılaştırıldığında, HORC modelleri dinamik hücresel ortamı ve karmaşık nörovasküler etkileşimleri yerinde tuttukları için avantajlıdır ve klinik çeviri için iyi bir model sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Şekil 1: İnsan gözünün arka oküler yapıları. Ön ve arka, retina katmanları şunlardır: sinir lifi tabakası (NFL), ganglion hücre tabakası (GCL), iç pleksiform tabaka (IPL), iç nükleer tabaka (INL), dış pleksiform tabaka (OPL), dış nükleer katman (ONL), fotoreceptör iç segmenti (IS) ve fotoreceptör dış katmanı (OS). Retina içindeki hücreler ganglion hücreleri (mavi), amakrin hücreler (sarı), bipolar hücreler (kırmızı), yatay hücreler (mor), çubuk fotoreceptörler (pembe) ve koni fotoreceptörlerini (yeşil) içerir. Vitreus retinanın ön kısmında bulunur. RPE, Bruch'un zarı, koroid ve sklera retinanın arka kısmında bulunur. Gösterilen görüntünün retinanın sadece şematik bir gösterimi olduğunu ve her katmandaki hücre/retina bağlantı oranının in vivo ayarının göstergesi olmayabileceğini unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Daha önce karakterize horc protokolleri6,7,8,9 cerrahi trefin kullanarak retina alttaki RPE-choroid ve sklera ayırmayı içermiştir. Bununla birlikte, bu alttaki yapıların sağladığı destek olmadan, yarı saydam retina zayıflar, kullanımı zorlaşır ve asalet gibi araçlar bütünlüğünü kolayca bozabilir. Ayrıca, RPE olmadan kültürde retina izole ederek ganglion hücre apoptoz ve fotoreceptör dejenerasyonu10,11,12neden olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, retina bütünlüğü kaybını en aza indiren ve in vivo ortamı daha iyi taklit eden alternatif bir HORC protokolü yararlı olacaktır. Bu özellikle retina hastalığı mekanizmalarını incelerken önemlidir, çünkü eksplant kullanımı sırasında fiziksel yaralanma eserlere neden olabilir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, explant kullanımı ve kültürü sırasında retina bütünlüğünü korumak için RPE-koroid ve sklera içeren yeni bir HORC modeli geliştirmekti.
Bu amaca ulaşmak için, artık vitreus ile alttaki RPE-choroid ve sklera arasında "sandviçlenmiş" retina eksplantları çıkarıldı. Sandviç eksplantlarında, vitreus retina dekolmanını ve katlanmasını önlemek için retinayı tartarken, sert, lifli sklera hem yapısal destek için bir iskele hem de forseps için bir temas noktası görevi görür. Dahası, hayvan modelleri, RPE'yi kültürde tutmanın retina dejenerasyonu ve glial çoğalmasını önleyebileceğini göstermiştir, Müller hücrelerinin hipoksi ve iltihaplanma gibi tehlike sinyallerine bir yanıtı10,11,12.
Modeli karakterize etmek için, sandviç retina eksplantları anatomik yapıları değerlendirmek için Hematoksilin ve Eosin (H&E) ile boyandı ve immünhistokimya (IHC) yapıldı, eksplantların terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick uç etiketlemesi (TUNEL, apoptotik hücre belirteci), glial fibril asidik protein (GFAP, retina iltihabı ve Müller hücre aktivasyon belirteci) ve Müller hücre bütünlüğünün bir belirteci olan vimentin ile etiketleme. Bu modelin moleküler hastalık belirtileri geliştirmek için indüklenip indüklenemeyeceği, eksplantlar, hem hücre hem de hayvan hastalıkları modellerinde diyabetik retinopatiyi (DR) taklit ettiği gösterilen kült bir ortam olan pro-enflamatuar sitokinler (Cyt), interlökin-1β (IL-1β) ve tümör nekroz faktör α (TNF-α) ile yüksek glikoz(HG)maruzkaldı. Luminex tahlilleri, DR modelinde kültür ortamına salınan sitokinleri ölçmek için kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td>
			<td>Integra York PA Inc., USA</td>
			<td>21909-142</td>
			<td>Referred as surgical trephines 
			in this article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>200-01B</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160; TNF-a</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>300-01A</td>
			<td>Working concentration: 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 &#181;g/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Nuclear stain. Working dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1&#215; antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100&#215; stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal GFAP-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9205</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Vimentin-Cy3</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#C9080</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>#11684795910</td>
			<td>Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of a novel human organotypic retinal culture technique

Önceki insan organotipik retina kültürü (HORC) modelleri müstakil retinalar kullanmıştır; bununla birlikte, retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera tarafından verilen yapısal destek olmadan, kırılgan retinanın bütünlüğü kolayca tehlikeye atılabilir. Bu çalışmanın amacı retina eksplantlarını kültlürken retina bütünlüğünü korumak için retina, RPE-koroid ve sklera içeren yeni bir HORC modeli geliştirmekti.
İris ve lensi çıkarmak için limbüs boyunca çevresel olarak kesildikten sonra, göz kapağını düzleştirmek için dört derin kesi yapıldı. Önceki HORC protokollerinin aksine, sadece retinayı değil, RPE-koroid ve sklerayı da kesmek için bir trefin kullanıldı. Ortaya çıkan üç katmanlı eksplantlar 72 saat boyunca kültürlendi. Anatomik yapıları değerlendirmek için hematoksilin ve Eozin lekeleme (H&E) kullanıldı ve retina eksplantları apoptoz, Müller hücre bütünlüğü ve retina iltihabı için immünhistokimya (IHC) ile karakterize edildi. Hastalık indüksiyon olasılığını doğrulamak için eksplantlar diyabetik retinopatiyi (DR) taklit etmek için yüksek glikoz (HG) ve pro-enflamatuar sitokinlere (Cyt) maruz kaldı. Luminex manyetik boncuk tahlili, kültür ortamına salınan DR ile ilişkili sitokinleri ölçmek için kullanıldı.
H&E lekeleme, alttaki RPE-choroid ve sklera ile retina eksplantlarında belirgin retinal lamel ve kompakt çekirdekler ortaya çıkarırken, alttaki yapılar olmayan retinalarda daha az kalınlık ve ciddi çekirdek kaybı gözlendi. IHC sonuçları apoptoz ve retina iltihabının yanı sıra korunmuş Müller hücre bütünlüğünün olmadığını gösterdi. Luminex tahlilleri, HG + Cyt'e maruz kalan retina eksplantlarında DR ile ilişkili pro-enflamatuar sitokinlerin 24 saat taban çizgisi seviyelerine göre salgılarının önemli ölçüde arttığını göstermiştir.
Retina bütünlüğünün apoptoz veya retina iltihabı olmadan korunduğu yeni bir HORC protokolünü başarıyla geliştirdik ve karakterize ettik. Ayrıca, retina eksplantlarını HG + Cyt'e maruz açıklarken DR ile ilişkili pro-enflamatuar biyobelirteçlerin indüklenmiş salgılanması, bu modelin klinik olarak çevrilebilir retina hastalığı çalışmaları için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu HORC modelinde retina bütünlüğü korunmuştur. Retina bütünlüğü kültürlü sandviç retina eksplantlarında korunmuş, ancak bitişik yapılar olmadan kültürlenmiş retinada kaybolmuştur. H&E, kültürde 72 saat sonra kesitli sandviç retina eksplantlarının yapısal bütünlüğünü incelemek için yapılmıştır. Sandviç retina eksplantları, INL ve ONL'de kompakt çekirdeklerle GCL'den ONL'ye korunmuş bütünlük ve belirgin bir lamel yapısı gös...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique at JoVE.com

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Bu teknik, tüm retina katmanlarını ve hücre tiplerini yerinde koruyarak hayvan ve in vitro modellere kıyasla klinik olarak daha alakalı hale getirir. Bu protokolün temel avantajı, sağlıklı ve hastalıklı retinayı karşılaştırırken gerekli olan doku elleçleme sırasında retina bütünlüğü bozulmasını en aza indirmesidir. Retina hastalıkları, dokuyu belirli koşullar altında kült ederek taklit edilebilir.Bu, yeni ilaç tedavilerinin testine izin verir. Diseksiyon ve numune toplama prosedürleri karmaşıktır. Bu nedenle, görsel gösterim okuyucuların yazılı protokolü anlamasına ve prosedürü başarıyla yürütmesine yardımcı olmak için kritik öneme sahiptir.Prosedürü gösteren charisse Kuo, laboratuvarımdan ikinci sınıf doktora öğrencisi. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12 ve bir kez antibiyotik ve antimykotik karışımı içeren kültür ortamını hazırlayın. İlk olarak, 500 mikrolitre ortayı 24 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatöre denge edin.Eksizyon ekstraksiyonu öncesinde ortamın hazır olması, daha sonra eklenme üzerine retinanın yerinden çıkarılmasını önler. Retina eksplantlarını çıkarmak için, göz kapağını iris ve lens yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirerek ve ONH Petri kabına temas ederek başlayın. Kirpik kullanarak kirpikte sabit tutun ve limbüsün dış kenarı boyunca çevresel olarak küçük kesikler yaparak iris ve lensi ayırın.İris ve lensi dikkatlice çıkarın, retinayı rahatsız etmekten kaçındığından emin olun. Parlak beyaz bir ışık kaynağı kullanarak ONH'yi tanımlayın ve daha kolay kullanım için Petri kabını döndüren ONH'ye doğru dört kadranda incise. Göz kapağını dikkatlice yayın ve düzleştirin.Retina bütünlüğünü bozmamak için tokmakları retina yerine sklera uygulayın. Hazırlanan ortamı içeren plakayı inkübatörden çıkarın. Retina kıvrımları olmayan bir bölgede retinaya cerrahi bir trefin yerleştirin ve petri kabını kırarken çatlama sesi üretmesi gereken skleraya nüfuz etmek için sert bastırın.Skleranın tam olarak nüfuz ettiğinden emin olmak için trephine'i döndürün, böyle şekilde retina eksplantı artık numunenin geri kalanından ayrılır. Skleradaki tokmakları uygulayın ve sandviç retina eksplantını kültür ortamına aktarın. Toplanan sandviç retinasının nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatöründe 72 saate kadar 37 santigrat derecede eksplantları kültüre edin.Hematoksilin ve eozin lekeleme, sandviç retinanın bütünlüğünü koruduğunu ve iç ve dış nükleer katmanlarda kompakt çekirdeklerle GCL'den ONL'ye kadar belirgin bir lamel yapısının korunduğunu göstermiştir. Retinanın alttaki RPE koroid ve skleradan koptuğu aynı örneğin kenarlarında retina kalınlığının azaldığı ve INL ve ONL'de çekirdek kaybını gösteren bozulmuş retina bütünlüğü bulundu. Bazal koşullarda kültürlenen retina eksplantlarında, 72 saat sonra bile sürekli hücresel canlılık gösteren tunel pozitif hücre çekirdeğine rastlanmadı.GFAP etiketlemesi glial fibrozis olmadan GCL ve IPL ile sınırlıydı, bu da GFAP'ın ONL'ye genişletilmiş ifadesi olarak tanımlanacak bir patoloji belirtisiydi. Vimentin, ganglion hücre tabakasından dış nükleer katmana kadar yüksek oranda ifade edildi ve normal retina dokularında görüldüğü gibi korunmuş Mueller hücre bütünlüğünü gösterdi. Luminex manyetik tahlil, IL-18, VEGF, IL-6 ve IL-8 seviyelerinin 24 saat sonra yüksek glikoz ve pro-enflamatuar sitokinlerde sandviç retina eksplant kültürlerinde taban çizgisinin önemli ölçüde üzerinde arttığını göstermiştir.72 saat sonra IL-18 ve VEGF seviyeleri önemli ölçüde artmış, ancak IL-6 ve IL-8 seviyelerinde anlamlı bir farka rastlanmadı. Bu işlemi yaparken, retinayı RP koroidinden ayrılmaması ve kültür medyasında yüzmemesi için tartacak yeterli artık vitreus bırakın. Kültürlü retina immünhistokimya ve histoloji kullanılarak daha da karakterize edilebilirken, kültürlü ortama salınan enflamatuar sitokinler Luminex manyetik bir test kullanılarak ölçülebilir.Bu model, retina hastalıkları için yeni terapötik ilaçların etkinliğini test etmek için daha uygun hale getiren hayvan ve in vitro modellerine kıyasla daha klinik olarak çevrilebilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Rescue Technique for Difficult Intubation and Difficult Ventilation

Zor entübasyon ve zor Havalandırma için Roman Kurtarma Tekniği

We describe a novel non surgical technique to maintain oxygenation and ventilation in a case of difficult intubation and difficult ventilation, which ...

A Novel Capsulorhexis Technique Using Shearing Forces with Cystotome

Cystotome ile Makaslama Kuvvetleri kullanma Roman kapsüloreksis Tekniği

Purpose:
To demonstrate a capsulorhexis technique using predominantly shearing forces with a cystotome on a virtual reality simulator and on a human eye....

A Novel Technique of Rescuing Capsulorhexis Radial Tear-out using a Cystotome

Bir Cystotome kullanarak Radyal Kurtarma kapsüloreksis Roman Tekniği Gözyaşı-

Part 1 : Purpose:   To demonstrate a capsulorhexis radial tear out rescue technique using a cystotome on a virtual reality cataract surgery simulator and ...

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Için Basitleştirilmiş Tekniği<em&gt; Yerinde</emİnsan Oküler Globe gelen Kornea ve Retina Doku Eviserasyon of&gt; eksizyonu

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Bir Roman kullanarak Terleme İzleme Detaylı Protokol, Küçük Kablosuz Aygıt

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...