Detta protokoll har många fördelar jämfört med den för närvarande använda jästmetabolomiken eftersom den har hög specificitet, hög känslighet, och det kan också profilera många olika klasser av metaboliter, inklusive isomeriska, isobariska, hydrofila och hydrofobiska molekyler. Den släckningsmetod som används i detta protokoll stoppar alla enzymatiska reaktioner samtidigt som läckaget av metaboliter från cellerna minskar avsevärt. MS1-biblioteket som är inbyggt i det här protokollet kommer från de olika MS2-körningarna.
Efter över natten kultur vid 30 grader Celsius och 200 varv per minut, bestämma antalet jästceller per milliliter kultur och tillsätt fem milliliter steriliserad 20%lagerlösning glukos till var och en av två Erlenmeyer flaskor som innehåller 45 milliliter autoklaver av autoklaverat YP medium per kolv. Använd en steril överföringspipett för att lägga till fem gånger 10 till de sjunde jästcellerna till varje kolv och odla jästcellerna i minst 24 extra timmar vid 30 grader Celsius vid 200 varv per minut. För metabolitextraktion, efter odling, samla jästcellerna genom centrifugation och ta snabbt bort supernatanten.
Placera röret på torris och tillsätt två milliliter minus 20 grader Celsius kloroform, en milliliter minus 20 grader Celsius metanol, en milliliter iskallt nano rent vatten och 200 mikroliter på 425 till 600 mikronsyra tvättade glaspärlor till cellerna. När pärlorna har tillsatts, placera röret täckt med aluminiumfolie i ett skumrörshållaresats med en hållare och virvel provet i 30 minuter med medelhastighet vid fyra grader Celsius för att underlätta metabolitextraktion. Inkubera sedan röret i 15 minuter på is innan provet centrifugerar för att möjliggöra separation av den övre vattenfasen från mellanskräpet och proteinet och lägre organiska faser.
Använd en mikropipett för att överföra cirka 400 mikroliter av den övre vattenfasen till ett tvättat och märkt 1,5 milliliter rör som innehåller 800 mikroliter minus 20 grader Celsius acetonitril. Centrifugera sedan provet och överför 800 mikroliter av den övre delen av supernaten till en märkt masspektrometriflaska för nollgradig lagring tills vätskekromatografi tandemmasspektrometrianalys. För att separera de extraherade metaboliterna, ultraljud provflaskan i 15 minuter, följt av tre 10-sekunders virvlar vid rumstemperatur.
Efter virvelvind, placera injektionsflaskan i brunnsplattan på vätskekromatografen och ställ in kolonnen på 45 grader Celsius med en flödeshastighet på 0,25 milliliter per minut och brunnsplattan till noll grader Celsius. Använd sedan tabellen för att ställa in de flytande kromatografigradienterna för analysen. Efter separationen, använd 10 mikroliterprovvolymer av injektionen i både elektrosprayjoniseringspositiva och negativa lägen i en masspektrometer utrustad med uppvärmd elektrosprayjonisering för att identifiera och kvantifiera vattenlösliga metaboliter.
I slutet av analysen, öppna rådata i ett lämpligt sammansatt analysprogram och använd masspektrafragmenteringsbiblioteket för att matcha masspektrat för att kommentera de metaboliter som identifierats i analysen. De exakta massorna av MS1- och isotopmönstren kan också identifieras för att möjliggöra annotering av metaboliterna med hjälp av onlinedatabaser. Använd sedan biblioteket med databaser och spektra för att söka efter MS2-spektrat för rådata.
Nästa dag, efter att ha släckt jästcellerna, tvätta cellerna noggrant med 15 milliliter ABC-buffert och samla cellerna genom centrifugation. Återanvänd pelleten i en milliliter färsk ABC-buffert och tillsätt 500 mikroliter av propidiumidlösningen till cellerna. Virvel provet tre gånger i 10 sekunder per virvel och inkubera cellerna i 10 minuter på is skyddad från ljus.
I slutet av inkubationen, samla cellerna genom centrifugation och tvätta cellerna tre gånger med en milliliter färsk ABC-buffert per tvätt. Efter den senaste tvätten, återanvänd pelleten i 300 mikroliter färsk ABC-buffert och tillsätt 10 mikroliter av den resulterande cellfjädringen till en mikroskopbild. Använd ett fluorescensmikroskop för att fånga differential interferens kontrast och fluorescens mikroskopi bilder av cellerna med filtren inställda på en excitation våglängd på 593 nanometer och en utsläpp våglängd på 636 nanometer.
Använd sedan ett lämpligt bildanalysprogram för att räkna det totala cellantalet celler i bilder av brightfield och fluorescens och för att bestämma färgningsintensiteten för enskilda celler. Den modifierade cellsläckande metoden orsakar betydligt lägre skador på plasmamembranet och cellväggen än den icke-buffrade 80%metanol vid minus 40 grader Celsius släckningsmetod. Faktum är att nästan alla celler som utsätts för släckning med den modifierade metoden uppvisar röda fluorescensutsläpp, vilket är karakteristiskt för jästceller där plasmamembranet och cellväggen inte skadas.
Däremot visade nästan alla celler som utsattes för släckning med den icke-buffrade 80%metanol vid 40 grader Celsius metod grönt fluorescensutsläpp, vilket är karakteristiskt för jästceller där plasmamembranet och cellväggen skadas avsevärt. Den modifierade cellsläckningsmetoden orsakar också betydligt lägre läckage av vattenlösliga metaboliter från jästceller än den icke-buffrade 80%metanol vid minus 40 grader Celsius släckningsmetod. Retentionstidens skiftvärden för vattenlösliga metabolitstandarder är betydligt lägre och toppformerna är betydligt skarpare för den zwitterioniska faskolonnen jämfört med den omvända faskolonnen.
En annan fördel med den flytande kromatografi tandem masspektrometri metoden är förmågan att använda zwitterionic faskolonnen för att effektivt separera olika vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper. Se till att propidiumidodiden står i mörker och se också till att samla den övre fasen utan att störa mittfasen. Om det inte går att kommentera msp på grund av bristen på MS2-spektralbiblioteket använder du en NMR för att illustrera den här strukturen.