Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31725023 ، 31861133019 إلى GW ، و 31171912 إلى CY).

1. تصميم الاشعال الخاصة بالجينات وإعداد sgRNA
<ol><li>التحقق من المنطقة الجينومية المحفوظة في الجين محل الاهتمام من خلال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليلات التسلسل. تضخيم الجين المستهدف من الحمض النووي الجينوم ل H. armigera وتمييز الإكسونات والإنترونات. ملاحظة: خصوصية تسلسل موقع الد?...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems.">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944 (2020).</li><li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science:+Current+status,+future+perspectives,+and+associated+challenges.">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li><li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

وقد وفر تطبيق نظام كريسبر/كاس9 دعما تقنيا قويا لتحليل وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة. يوضح البروتوكول المفصل الذي نقدمه هنا توليد متحور متماثل الزيجوت في H. armigera عبر تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. يوفر هذا الإجراء الموثوق به طريقة مباشرة لتكوين الطفرات الجينية الموجهة في H. armiger...

يوفر تطبيق تكنولوجيا تحرير الجينوم أداة فعالة لتحقيق طفرات الجينات المستهدفة في الأنواع المتنوعة. يوفر ظهور نظام التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام (CRISPR)/البروتين المرتبط به 9 (Cas9) طريقة جديدة للتعامل مع الجينوم1. يتكون نظام CRISPR/Cas9 من الحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNA) و Cas9 endonuclease2,3، في حين يمكن تقسيم الحمض النووي الريبي للحمض النووي الريبي (gRNA) إلى قسمين، الحمض النووي الريبي التكميلي المستهدف (crRNA) والحمض النووي الريبي التكميلي المستهدف (crRNA). يتكامل الحمض النووي الريبي مع إندونوكلياز كاس9 ويشكل البروتين الريبي النووي (RNP). مع الحمض النووي الريبوزي المرسال ، يمكن توجيه Cas9 endonuclease إلى موقع معين من الجينوم عبر تكملة القاعدة. يشق مجالا RuvC و HNH في Cas9 الموقع المستهدف للجينوم ثلاث قواعد قبل تسلسل الزخارف المتاخمة للفاصل الأولي (PAM) ويخلقان كسرا مزدوجا (DSB). يمكن بعد ذلك إصلاح انقسام الحمض النووي من خلال آليتين ، الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ) أو الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)4. إصلاح DSB يقدم عمليات الإدراج أو الحذف كوسيلة لتعطيل الجين المستهدف ، مما قد يتسبب في فقدان كامل لوظيفة الجينات. وبالتالي، فإن وراثة وخصوصية نظام كريسبر/كاس9 تجعله طريقة قوية لتوصيف وظائف الجينات في الجسم الحي وتحليل التفاعلات الجينية5.
مع العديد من المزايا ، تم تطبيق نظام CRISPR / Cas9 في مختلف المجالات ، بما في ذلك الطب الحيوي 6،7 ، والعلاج الجيني 8،9 ، والزراعة 10،11،12 ، وتم استخدامه لمختلف الأنظمة البيولوجية بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة 13 ، والنباتات 14،15 ، والديدان الخيطية16 ، والثدييات17 . في اللافقاريات ، خضعت العديد من أنواع الحشرات لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 ، مثل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر وما بعدها 18،19،20،21،22.
Helicoverpa armigera هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في جميع أنحاء العالم23 ، وتضر بالعديد من المحاصيل ، بما في ذلك القطن وفول الصويا والذرة الرفيعة24،25. مع تطور تكنولوجيا التسلسل ، تم تسلسل جينوم H. armigera ، وكذلك جينوم مجموعة من أنواع الحشرات Lepidoptera ، بالكامل26،27،28،29. تم تحديد عدد كبير من جينات المقاومة والمستقبلات الشمية وتمييزها من هذه الحشرات في السنوات الأخيرة19،27،28،29. تم تحديد بعض الجينات المرتبطة بالمقاومة في H. armigera ، مثل الجينات المشفرة ل cadherin30 ، وهو ناقل كاسيت ملزم ATP31,32 ، وكذلك HaTSPAN133. يؤدي التخلص من هذه الجينات باستخدام تقنية CRISPR / Cas9 إلى مستوى عال من المقاومة لتوكسين Bacillus thuringiensis (BT) في السلالات الحساسة. أيضا ، قام Chang et al. (2017) بإخراج مستقبل الفيرومون ، والذي أثبت صحة وظيفته المهمة في تنظيم وقت التزاوج 19. تشير هذه التقارير إلى أن كريسبر / كاس9 يمكن أن يكون بمثابة أداة فعالة لدراسة وظيفة الجينات في الجسم الحي في أنظمة الحشرات. ومع ذلك، لا يزال الإجراء التفصيلي لتعديل كريسبر/كاس9 في أنظمة الحشرات غير مكتمل، مما يحد من نطاق تطبيقه في علم الجينوم الوظيفي للحشرات.
هنا ، نقدم بروتوكولا لضرب جين وظيفي في H. armigera باستخدام نظام CRISPR / Cas9. يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة ، بما في ذلك تصميم وإعداد الاشعال الخاصة بالجينات لإنتاج الحمض النووي الريبوزي المرسال ، وجمع الأجنة ، والحقن المجهري ، وتربية الحشرات ، وتحديد الطفرات. يعمل هذا البروتوكول كمرجع قيم للتعامل مع أي جينات وظيفية في H. armigera ويمكن توسيعه ليشمل أنواع Lepidoptera الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

دودة القطن ، Helicoverpa armigera ، هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في العالم. مزيج من علم الوراثة الجزيئية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وعلم الجينوم الوظيفي ، والدراسات السلوكية جعلت H. armigera نوعا نموذجيا في Lepidoptera Noctuidae. لدراسة وظائف الجينات المختلفة والتفاعلات بين الجينات المختلفة في الجسم الحي ، تعد تقنية تحرير الجينوم المجمعة بانتظام (CRISPR) / البروتين المرتبط بها 9 (Cas9) طريقة مريحة وفعالة تستخدم لإجراء دراسات جينومية وظيفية. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة منهجية خطوة بخطوة لإكمال الضربة القاضية للجين في H. armigera باستخدام نظام CRISPR / Cas9. يتم وصف تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNA) بالتفصيل. بعد ذلك ، يتم تلخيص الخطوات اللاحقة التي تتكون من تصميم تمهيدي خاص بالجينات لإنشاء الحمض النووي الريبي الموجه (gRNA) ، وجمع الأجنة ، والحقن المجهري ، وتربية الحشرات ، والكشف عن الطفرات. وأخيرا، يتم تقديم المشورة والملاحظات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين كفاءة تحرير الجينات. ستكون طريقتنا بمثابة مرجع لتطبيق تحرير جينوم CRISPR / Cas9 في H. armigera بالإضافة إلى عث Lepidopteran الآخر.

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة للحصول على خطوط الضربة القاضية الجينية ل H. armigera باستخدام تقنية CRISPR / Cas9. يتم تلخيص النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول لاختيار الحمض النووي ، وجمع الأجنة وحقنها ، وتربية الحشرات ، والكشف عن الطفرات.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

يظهر هنا بروتوكول الحقن المجهري للأجنة Helicoverpa armigera (Hübner) وتحديد الطفرات بالضربة القاضية التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. تتيح الحشرات الطافرة إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في الجسم الحي.

الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

دودة القطن هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في جميع أنحاء العالم. يتيح تحرير الجينوم باستخدام تقنية CRISPR / Cas9 إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في هذا الكائن الحي. الميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية هما أنها تتمتع بخصوصية عالية وقابلة للوراثة.من أجل اختيار أهداف sgRNA ، انتقل إلى موقع CRISPR على الإنترنت للبحث عن مواقع الدليل المحتملة والإكسونات القريبة من المنطقة الخمسة الرئيسية غير المترجمة من الجين. أدخل تسلسل exon في مربع النص وحدد الجينوم المستهدف إلى Helicoverpa armigera. اختر خيار PAM ل 20 BPNGG واترك الإعدادات الأخرى على المعلمات الافتراضية ، وفقا لأدلة المستخدم الخاصة بموقع الويب.قارن تسلسلات الدليل المتوقعة من البرنامج واختر تسلسل دليل من 20 زوجا أساسيا يحتوي على واحد أو اثنين من الأغوانيس بالقرب من المنطقة الخمسة الرئيسية غير المترجمة بأعلى كفاءة متوقعة وأقل عدد من عدم التطابق لتحسين كفاءة التحرير وتقليل التحرير خارج الهدف. لإعداد الأجنة ، اختر 50 فردا سليما من الذكور الذين يبلغون من العمر ثلاثة أيام والإناث في عمر يومين ، واخلطهم في قفص شبكي نظيف. ضع قطعة من القطن الرطب تحتوي على محلول سكر 10٪ في القفص.قم بتغطية الأقفاص الصافية بالشاش وقم بإصلاح الشاش بشريط مطاطي. رش الماء على الشاش للحفاظ على رطوبةه. قطع قطعة قماش سوداء إلى حجم مناسب واستبدل الشاش الرطب بهذه القطعة السوداء لتمكين وضع البويضة مجانا لمدة 30 دقيقة.الصق شريطا على الوجهين على شريحة المجهر. باستخدام الملقط ، الصق البقع بالبيض على التوالي على سطح الشريط على الوجهين. اضغط على هامش كل رقعة للتأكد من أنها تلتصق بإحكام بالشريط.جمع 50 إلى 100 بيضة لكل شريحة مجهرية. قبل الحقن المجهري ، حافظ على انزلاق المجهر على الجليد لتأخير تطور الأجنة. قم بإعداد الإبرة عن طريق سحب زجاج شعري باستخدام مجتذب ماصة صغيرة كما هو موضح في مخطوطة النص.طحن طرف الإبرة باستخدام مطحنة صغيرة إلى طرف حاد الحواف. قم بإعداد حلول الحقن عن طريق إضافة ميكرولترين من بروتين Cas9 التجاري و sgRNA إلى الماء الخالي من RNace في أنبوب PCR للحصول على خليط بحجم 10 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق السحب ووضعها على الجليد.تعيين معلمات الحاقن الإلكتروني الصغير. قم بتحميل ميكرولترين من الخليط في إبرة باستخدام طرف ماصة microloader ، مما يستنفد أكبر قدر ممكن من الهواء المتبقي في طرف الإبرة. قم بتوصيل إبرة الحقن بجهاز مناور دقيق وتأكد من وجود اتصال وثيق بين الجزأين.ضع شريحة في طبق بتري وضعها على مسرح المجهر. أدخل طرف الإبرة بعناية في نصف الكرة العلوي للجنين بزاوية 45 درجة. اضغط على الدواسة لتوصيل الخليط إلى الجنين، مما يؤدي إلى توسع طفيف في الجنين.اسحب الإبرة على الفور من الجنين وحرك طبق بتري بيد واحدة حتى يصبح الجنين التالي قريبا من الإبرة. حقن ما لا يقل عن 300 جنين باستخدام نفس الإجراء لضمان كمية كافية من الفقس. قم بتغطية غطاء أطباق بتري بعد الحقن.عندما يصبح لون سطح الأجنة مظلما ، ضع نظاما غذائيا اصطناعيا في طبق بتري حول شريحة المجهر. قم بإعداد لوحات استزراع من 24 بئرا واملأ كل بئر إلى 1/3 من طاقتها الحجمية بنظام غذائي اصطناعي. اختر يرقة الفقس باستخدام فرشاة طلاء صغيرة وانقلها إلى لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا ، بحيث تحتوي البئر الواحدة على يرقة واحدة.عندما تنمو اليرقة إلى المرحلة الثالثة من instar ، قم بنقلها إلى إيثرا دكتايل زجاجي جديد. انقل البالغين الذكور G-zero المغلقين حديثا والإناث البالغات من النوع البري إلى قفص شبكي جديد بنسبة متساوية. تزويدهم بمحلول سكر بنسبة 10٪ يسقط في كرات قطنية.الحشرات الخلفية باستخدام الطرق الروتينية حتى جرو G-one. استخدم الملقط لإزالة الساق الخلفية بعناية ووضع كل ساق في أنبوب مصفوفة Lysing Matrix. تجانس الساق الخلفية باستخدام مجانس الأنسجة.استخراج الحمض النووي الجينومي للعينة المتجانسة باستخدام مجموعة استخراج gDNA التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تضخيم الجزء الجيني باستخدام التمهيدي التنميط الجيني وظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل من مخطوطة النص. تأكد من النمط الوراثي من خلال خدمة التسلسل الجيني.ضع أفراد G-one من نفس النمط الوراثي في قفص شبكي واحد ، وعبر ذرية G-one ذاتيا واستمر في الفحص باستخدام نفس الطرق. كان الموقع المستهدف للجين محل الاهتمام موجودا في إكسون الثاني. تم الحفاظ على هذا الموقع بشكل كبير وتم تأكيد جزء النطاق المستهدف من sgRNA المركب باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.تم إجراء الكشف عن الطفرات لهدف sgRNA واحد عن طريق تسلسل منتجات PCR من الوحدات الأبوية G-one. وقد أثبتت فعالية استخدام أزواج sgRNA غير المتداخلة عبر إكسونات مختلفة حيث تم تمييز الحذف الكبير للطفرات بسهولة عن المقالي من النوع البري. بعد الحصول على عدد معين من الأفراد المتحورين ، يمكن إجراء تجارب كهروفسيولوجية أو سلوكية لتوضيح وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

الأزقة اختبار متتالية من القلق في الفئران والجرذان

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

حقن مكروي التجسيمي من ناقلات فيروسية وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور إلى دراسة دور الجينات المستهدفة في الكوكايين مكيفة مكان ميول

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

القوارض الدماغ Microinjection لدراسة ركائز الجزيئي للسلوك الدوافع

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

كلي خلق مركب الوجه واللاحقة الخط الهاتفي فيديو شاهد عيان تحديد النموذج

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

غرس والتسجيلات مخطط كهربية اللاسلكية والجهد البصري المحرض في الجرذان واعية

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

التلاعب صرعي Electrocorticograms (ECoGs) والنوم في الجرذان والفئران التي الوخز بالإبر

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

انقطاع العمل والنموذج استئناف للاختبار تفعيل والسعي من التفكير هدف الملخص

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

أساليب المزاوجة وصيانة زوج من نيوزيلندا الأبيض الأرانب (Oryctolagus Cuniculus) عن طريق اثوجرام السلوكية، الرصد، والتدخلات

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

تتبع السلوكية وتصوير نيوروماست من كافيفيش المكسيكية

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

التحفيز الحالي المباشر عبر الجمجمة (tDCS) من مناطق فيرنيك وبروكا في دراسات تعلم اللغة واكتساب الكلمات

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...