Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW og 31171912 til CY).

1. Design af genspecifikke primere og fremstilling af sgRNA
<ol><li>Bekræft en bevaret genomisk region i genet af interesse gennem PCR-amplifikation og sekventeringsanalyser. Forstærk målgenet fra genom-DNA'et fra H. armigera og skelne mellem exons og introner. BEMÆRK: Sekvenssspecifikationen for guidestedet er nødvendig for at undgå genredigering uden for målet. Søg mulige guidesteder i exons er tæt på 5 'UTR af genet. Derefter er det vigtigt at sikre, at genet er helt ikke-funktionelt. Et resum?...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems.">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944 (2020).</li><li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science:+Current+status,+future+perspectives,+and+associated+challenges.">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li><li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

Anvendelsen af CRISPR/Cas9-systemet har givet kraftig teknisk støtte til analyse af genfunktion og interaktion mellem forskellige gener. Den detaljerede protokol, vi præsenterer her, viser dannelsen af en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR /Cas9 genomredigering. Denne pålidelige procedure giver en ligetil måde for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget af CRISPR-målsteder kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokol sammenl...

Anvendelsen af genomredigeringsteknologi giver et effektivt værktøj til at opnå målgenmutanter i forskellige arter. Fremkomsten af det klyngede system med regelmæssigt indbyrdes mellemrum med korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/associeret protein 9 (Cas9) giver en ny metode til at manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består af et guide-RNA (gRNA) og Cas9-endonuklease2,3, mens gRNA'et yderligere kan opdeles i to dele, et målkomplementært CRISPR-RNA (crRNA) og et transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA'et integreres med Cas9-endonuklease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA'et kan Cas9-endonuklease ledes til et bestemt sted i genomet via basekomplementering. RuvC- og HNH-domænerne i Cas9 spalter målet for genomet tre baser før den protospacer-tilstødende motivsekvens (PAM) og skaber en dobbeltstrengsbrud (DSB). DNA-spaltningen kan derefter repareres gennem to mekanismer, ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) eller homologistyret reparation (HDR)4. Reparation af DSB introducerer indsættelser eller deletioner som en måde at inaktivere det målrettede gen på, hvilket potentielt kan forårsage et fuldstændigt tab af genfunktion. Derfor gør CRISPR/Cas9-systemets arvelighed og specificitet det til en robust metode til at karakterisere genfunktioner in vivo og analysere geninteraktioner5.
Med mange fordele er CRISPR/Cas9-systemet blevet anvendt på forskellige områder, herunder biomedicin6,7, genterapi8,9 og landbrug10,11,12, og er blevet anvendt til forskellige biologiske systemer, herunder mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . Hos hvirvelløse dyr har mange insektarter været udsat for CRISPR/Cas9-genomredigering, såsom bananfluen Drosophila melanogaster og derover18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er et af de mest ødelæggende skadedyr på verdensplan23 og beskadiger adskillige afgrøder, herunder bomuld, sojabønner og sorghum24,25. Med udviklingen af sekventeringsteknologi er genomet af H. armigera såvel som for en række Lepidoptera insektarter blevet sekventeret fuldstændigt26,27,28,29. Et stort antal resistens- og olfaktoriske receptorgener er blevet identificeret og karakteriseret fra disse insekter i de senere år19,27,28,29. Nogle resistensrelaterede gener er blevet identificeret i H. armigera, såsom de gener, der koder for cadherin30, en ATP-bindende kassettetransportør31,32 samt HaTSPAN133. Knockout af disse gener ved hjælp af CRISPR/Cas9-teknologi resulterer i en høj grad af resistens over for Bacillus thuringiensis (BT) toksin i modtagelige stammer. Chang et al. (2017) slog også en feromonreceptor ud, som validerede dens signifikante funktion i parringstidsregulering19. Disse rapporter tyder på, at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt redskab til at studere genfunktionen in vivo i insektsystemer. En detaljeret procedure for CRISPR/Cas9-modifikation i insektsystemer er dog fortsat ufuldstændig, hvilket begrænser dens anvendelsesområde inden for insektfunktionel genomik.
Her præsenterer vi en protokol til at slå et funktionelt gen ud i H. armigera ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. En detaljeret trin-for-trin protokol leveres, herunder design og forberedelse af genspecifikke primere til gRNA-produktion, embryoopsamling, mikroinjektion, insektopdræt og mutantidentifikation. Denne protokol tjener som en værdifuld reference til at manipulere eventuelle funktionelle gener i H. armigera og kan udvides til andre Lepidoptera-arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

Bomuldsbollormen, Helicoverpa armigera, er et af de mest destruktive skadedyr i verden. En kombination af molekylær genetik, fysiologi, funktionel genomik og adfærdsstudier har gjort H. armigera til en modelart i Lepidoptera Noctuidae. For at studere in vivo-funktionerne af og interaktionerne mellem forskellige gener er clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode, der anvendes til at udføre funktionelle genomiske undersøgelser. I denne undersøgelse giver vi en trinvis systematisk metode til at fuldføre genknockout i H. armigera ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. Design og syntese af guide RNA (gRNA) er beskrevet detaljeret. Derefter opsummeres de efterfølgende trin, der består af genspecifikt primerdesign til oprettelse af guide-RNA (gRNA), embryoopsamling, mikroinjektion, insektopdræt og mutantdetektion. Endelig gives fejlfindingsråd og noter for at forbedre effektiviteten af genredigering. Vores metode vil tjene som reference for anvendelsen af CRISPR/Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møl.

Denne protokol indeholder detaljerede trin til opnåelse af genudstømningslinjer af H. armigera ved hjælp af CRISPR / Cas9-teknologi. De repræsentative resultater opnået ved denne protokol er opsummeret for gDNA-udvælgelse, embryoopsamling og injektion, insektopdræt og mutantdetektion.
I denne undersøgelse var målstedet for vores gen af interesse placeret i dets anden exon (figur 2A...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

Præsenteret her er en protokol over Helicoverpa armigera (Hübner) embryomikroinjektion og knockout mutant identifikation skabt af CRISPR / Cas9 genomredigering. Mutante insekter muliggør yderligere forskning i genfunktion og interaktion mellem forskellige gener in vivo.

Embryomikroinjektion og knockout-mutant identifikation af CRISPR/Cas9-genomredigeret Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Bomuldsbollorm er et af de mest destruktive skadedyr på verdensplan. Genomredigering med CRISPR/Cas9-teknologien muliggør yderligere forskning i genfunktion og interaktion mellem forskellige gener i denne organisme. De to største fordele ved denne teknik er, at den har høj specificitet og er arvelig.For at vælge sgRNA-målene skal du gå til CRISPR's online hjemmeside for at søge efter mulige guidesider og exons tæt på de fem primære uoversatte regioner i genet. Indtast exon-sekvensen i tekstfeltet, og vælg målgenomet til Helicoverpa armigera. Vælg PAM-indstillingen for 20 BPNGG, og lad de andre indstillinger være på standardparametrene i henhold til brugermanualerne på webstedet.Sammenlign de forudsagte guidesekvenser fra softwaren, og vælg en guidesekvens på 20 basepar, der indeholder en eller to guaniner nær det fem primære uoversatte område med den højeste forudsagte effektivitet og færrest uoverensstemmelser for at forbedre redigeringseffektiviteten og reducere redigering uden for målet. Til embryoforberedelse skal du vælge 50 raske individer fra tre dage gamle mænd og to dage gamle kvinder og blande dem i et rent netbur. Anbring et stykke fugtig bomuld indeholdende 10% sukkeropløsning i buret.Dæk netburene med gasbind og fastgør gasbindet med et gummibånd. Sprøjt vand på gasbindet for at holde det fugtigt. Skær en sort klud i en passende størrelse og udskift den fugtige gasbind med denne sorte klud for at muliggøre fri ægstilling i 30 minutter.Indsæt dobbeltsidet tape på et mikroskopdias. Brug tang til at indsætte pletterne med æg i træk på overfladen af det dobbeltsidede bånd. Tryk på margenen på hvert plaster for at sikre, at de klæber fast til båndet.Saml 50 til 100 æg pr. Mikroskop dias. Før mikroinjektion skal du holde mikroskopet glide på is for at forsinke udviklingen af embryoner. Forbered nålen ved at trække i et kapillærglas ved hjælp af en mikropipettetrækler som beskrevet i tekstmanuskriptet.Slib nålespidsen ved hjælp af en mikrokværn til en skarpkantet spids. Forbered injektionsopløsninger ved at tilsætte to mikroliter kommercialiseret Cas9-protein og sgRNA til RNace-frit vand i et PCR-rør for at opnå 10 mikroliter volumenblanding. Bland godt ved pipettering og læg det på is.Indstil parametrene for den elektroniske mikroinjektor. Læg to mikroliter af blandingen i en nål ved hjælp af en mikrolæsserpipettespids, og udtøm så meget resterende luft i spidsen af nålen som muligt. Tilslut injektionsnålen til en mikromanipulator, og sørg for en tæt forbindelse mellem de to dele.Placer et dias i en petriskål og læg det på mikroskopets scene. Indsæt forsigtigt nålespidsen i den øverste halvkugle af et embryo i en 45 graders vinkel. Tryk på pedalen for at levere blandingen ind i embryoet, hvilket fører til en lille udvidelse af embryoet.Træk nålen straks tilbage fra embryoet og flyt petriskålen med den ene hånd, indtil det næste embryo er i nærheden af nålen. Mindst 300 embryoner injiceres efter samme procedure for at sikre en tilstrækkelig udklækningsmængde. Dæk låget på petriskålene efter injektion.Når embryonernes overfladefarve er blevet mørkere, skal du lægge kunstig kost i petriskålen omkring mikroskopets dias. Forbered 24-brønds kulturplader og fyld hver brønd til 1/3 af dens volumetriske kapacitet med kunstig kost. Pluk rugelarven ud ved hjælp af en lille pensel og overfør dem til kulturpladen med 24 brønde, således at en brønd har en larve.Når larven vokser til det tredje instar-stadium, skal du overføre dem til en ny glasdugtil ethrae. Overfør de nyligt lukkede G-zero mandlige voksne og vildtype kvindelige voksne til et frisk netbur i et lige forhold. Forsyn dem med 10% sukkeropløsning faldet i bomuldskugler.Bageste insekter ved hjælp af rutinemæssige metoder indtil hvalpen af G-one. Brug tang til forsigtigt at fjerne et bagben og læg hvert ben i et Lysing Matrix-rør. Homogeniser bagbenet ved hjælp af en vævshomogenisator.Uddrag det genomiske DNA fra den homogeniserede prøve ved hjælp af et kommercielt gDNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger. Forstærk gensegmentet ved hjælp af genolysningsprimere og PCR-reaktionsbetingelserne fra tekstmanuskriptet. Bekræft genotypen med en gensekventeringstjeneste.Sæt G-en individer af samme genotype i et netbur, selv krydse G-one afkom og fortsæt med at screene ved hjælp af de samme metoder. Målstedet for genet af interesse var placeret i sin anden exon. Dette sted blev stærkt bevaret, og målbåndsfragmentet af syntetiseret sgRNA blev bekræftet ved anvendelse af agarosegelelektroforese.Den mutante påvisning af et enkelt sgRNA-mål blev udført ved at sekventere PCR-produkterne fra G-one-forældreenheder. Effektiviteten af at anvende ikke-overlappende sgRNA-par på tværs af forskellige exoner blev påvist, da den store deletion af mutanterne let kunne skelnes fra vildtypepanderne. Efter opnåelse af et vist antal mutante individer kan elektrofysiologiske eller adfærdsmæssige eksperimenter udføres for at afklare genfunktion og interaktion mellem forskellige gener.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

Den Successiv Alleys Test af angst hos mus og rotter

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Stereotaktisk Mikroinjektion af virale vektorer, der udtrykker Cre recombinase at undersøge den rolle, målgener i Kokain Konditioneret Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Gnaverhjerne Mikroinjektion at studere Molekylær Substrater af motiveret adfærd

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

Holistisk Facial Composite oprettes og efterfølgende video line-up øjenvidne Identifikation Paradigm

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

Implantation og Registrering af Wireless elektroretinogrammet og visuelt fremkaldt potentiale i vågne rotter

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation af epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) og Sleep i rotter og mus ved akupunktur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

Opgave Afbrydelse og genoptagelse Paradigm for Testing Aktivering og udøvelse af en abstrakt tænkning Goal

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Metoder på parring og par vedligeholdelse af New Zealand hvide kaniner (Oryctolagus Cuniculus) Via adfærdsmæssige Ethogram, overvågning, og interventioner

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

Adfærdsmæssige Tracking og Neuromast billeddannelse af mexicanske Cavefish

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial jævnstrøm stimulering (tDCS) af Wernickes og Broca's områder i studier af sprogindlæring og Orderhvervelse

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...