Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 voor GW en 31171912 voor CY).

1. Ontwerp van genspecifieke primers en bereiding van sgRNA
<ol><li>Verifieer een geconserveerd genomisch gebied in het gen van belang door middel van PCR-amplificatie- en sequencinganalyses. Amplificeer het doelgen uit het genoom-DNA van H. armigera en onderscheid de exonen en introns. OPMERKING: De sequentiespecificiteit van de gidssite is noodzakelijk om off-target genbewerking te voorkomen. Zoek mogelijke gidsplaatsen in de exonen liggen dicht bij de 5' UTR van het gen. Dan is het belangrijk om ervoor t...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems.">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944 (2020).</li><li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science:+Current+status,+future+perspectives,+and+associated+challenges.">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li><li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

De toepassing van het CRISPR/Cas9-systeem heeft krachtige technische ondersteuning geboden voor de analyse van de genfunctie en interactie tussen verschillende genen. Het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, toont de generatie van een homozygote mutant in H. armigera via CRISPR / Cas9-genoombewerking. Deze betrouwbare procedure biedt een eenvoudige manier voor gerichte genmutagenese bij H. armigera.
De keuze van crispr-doellocaties kan van invloed zijn op de <sup ...

De toepassing van genoombewerkingstechnologie biedt een efficiënt hulpmiddel om doelgenmutanten in diverse soorten te bereiken. De opkomst van het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) systeem biedt een nieuwe methode om genomen te manipuleren1. Het CRISPR/Cas9-systeem bestaat uit een geleidings-RNA (gRNA) en het Cas9-endonuclease2,3, terwijl het gRNA verder kan worden onderverdeeld in twee delen, een doel complementair CRISPR-RNA (crRNA) en een trans-activerend crRNA (tracrRNA). Het gRNA integreert met Cas9 endonuclease en vormt een ribonucleoproteïne (RNP). Met het gRNA kan Cas9-endonuclease via basecomplementatie naar een specifieke plaats van het genoom worden geleid. De RuvC- en HNH-domeinen van de Cas9 splitsen de doellocatie van het genoom drie basen voor de protospacer-adjacent motif (PAM) -sequentie en creëren een dubbelstrengsbreuk (DSB). De DNA-splitsing kan vervolgens worden gerepareerd via twee mechanismen, niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologiegerichte reparatie (HDR)4. Reparatie van de DSB introduceert inserties of deleties als een manier om het beoogde gen te inactiveren, wat mogelijk een volledig verlies van genfunctie veroorzaakt. Vandaar dat de herbewerkbaarheid en specificiteit van het CRISPR/Cas9-systeem het een robuuste methode maken om genfuncties in vivo te karakteriseren en geninteracties te analyseren5.
Met tal van verdiensten is het CRISPR/Cas9-systeem toegepast op verschillende gebieden, waaronder biogeneeskunde6,7, gentherapie8,9 en landbouw10,11,12, en is het gebruikt voor verschillende biologische systemen, waaronder micro-organismen13, planten14,15, nematoden16 en zoogdieren17 . Bij ongewervelde dieren zijn veel insectensoorten onderworpen aan CRISPR/Cas9-genoombewerking, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster en verder dan 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera is een van de meest destructieve plagen ter wereld23 en beschadigt tal van gewassen, waaronder katoen, sojabonen en sorghum24,25. Met de ontwikkeling van sequencingtechnologie zijn het genoom van H. armigera, evenals dat van een reeks Lepidoptera-insectensoorten, volledig gesequenced26,27,28,29. Een groot aantal resistentie- en reukreceptorgenen is de afgelopen jaren geïdentificeerd en gekarakteriseerd van deze insecten19,27,28,29. Sommige resistentiegerelateerde genen zijn geïdentificeerd in H. armigera, zoals de genen die coderen voor cadherin30, een ATP-bindende cassettetransporter31,32, evenals HaTSPAN133. Knock-out van deze genen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie resulteert in een hoge mate van resistentie tegen Bacillus thuringiensis (BT) toxine in gevoelige stammen. Ook sloegen Chang et al. (2017) een feromoonreceptor uit, die zijn significante functie in paringstijdregulatie valideerde19. Deze rapporten suggereren dat CRISPR/Cas9 kan fungeren als een effectief hulpmiddel om de genfunctie in vivo in insectensystemen te bestuderen. Een gedetailleerde procedure voor CRISPR/Cas9-modificatie in insectensystemen blijft echter onvolledig, wat het toepassingsgebied ervan in functionele genomica voor insecten beperkt.
Hier presenteren we een protocol voor het uitschakelen van een functioneel gen in H. armigera met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Een gedetailleerd stapsgewijs protocol wordt verstrekt, inclusief het ontwerp en de voorbereiding van genspecifieke primers voor gRNA-productie, embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantidentificatie. Dit protocol dient als een waardevolle referentie om functionele genen in H. armigera te manipuleren en kan worden uitgebreid naar andere Lepidoptera-soorten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

De katoenbolworm, Helicoverpa armigera, is een van de meest destructieve plagen ter wereld. Een combinatie van moleculaire genetica, fysiologie, functionele genomica en gedragsstudies heeft van H. armigera een modelsoort gemaakt in Lepidoptera Noctuidae. Om de in vivo functies van en interacties tussen verschillende genen te bestuderen, is geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / geassocieerd eiwit 9 (Cas9) genoombewerkingstechnologie een handige en effectieve methode die wordt gebruikt voor het uitvoeren van functionele genomische studies. In deze studie bieden we een stapsgewijze systematische methode om gen knock-out in H. armigera te voltooien met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Het ontwerp en de synthese van gids-RNA (gRNA) worden in detail beschreven. Vervolgens worden de volgende stappen, bestaande uit genspecifiek primerontwerp voor het maken van gids-RNA (gRNA), embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantendetectie samengevat. Ten slotte worden advies en opmerkingen over het oplossen van problemen verstrekt om de efficiëntie van genbewerking te verbeteren. Onze methode zal dienen als referentie voor de toepassing van CRISPR/Cas9 genoombewerking in H. armigera en andere Lepidoptera motten.

Dit protocol biedt gedetailleerde stappen voor het verkrijgen van gen knock-out lijnen van H. armigera met behulp van CRISPR / Cas9-technologie. De representatieve resultaten verkregen door dit protocol worden samengevat voor gDNA-selectie, embryoverzameling en -injectie, insectenopfok en mutantendetectie.
In deze studie bevond de doelplaats van ons interessante gen zich in zijn tweede exon (figuur ...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Katoenbolworm is een van de meest destructieve plagen ter wereld. Genoombewerking met de CRISPR/Cas9-technologie maakt verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in dit organisme mogelijk. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge specificiteit heeft en herbewerkbaar is.Om de sgRNA-doelen te kiezen, gaat u naar de crispr online website om te zoeken naar mogelijke gidsplaatsen en de exonen in de buurt van de vijf belangrijkste onvertaalde regio's van het gen. Voer de exonsequentie in het tekstvak in en selecteer het doelgenoom voor Helicoverpa armigera. Kies de PAM-optie voor 20 BPNGG en laat de andere instellingen op de standaardparameters staan, volgens de gebruikershandleidingen van de website.Vergelijk de voorspelde gidssequenties uit de software en kies een gidssequentie van 20 basenparen met een of twee guanines in de buurt van het vijf priemgetalde onvertaalde gebied met de hoogste voorspelde efficiëntie en de minste mismatches om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren en off-target bewerking te verminderen. Selecteer voor embryovoorbereiding 50 gezonde individuen uit drie dagen oude mannetjes en twee dagen oude vrouwtjes en meng ze in een schone netkooi. Plaats een stuk vochtig katoen met 10% suikeroplossing in de kooi.Bedek de netkooien met gaas en bevestig het gaas met een elastiekje. Spuit water op het gaas om het vochtig te houden. Snijd een zwarte doek in een geschikte maat en vervang het vochtige gaas door deze zwarte doek om gedurende 30 minuten vrije eicellen mogelijk te maken.Plak dubbelzijdige tape op een microscoopglaasje. Plak met een tang de pleisters met eieren op een rij op het oppervlak van de dubbelzijdige tape. Druk op de marge van elke patch om ervoor te zorgen dat ze stevig aan de tape blijven plakken.Verzamel 50 tot 100 eieren per microscoopglaasje. Houd vóór micro-injectie de microscoopglaas op ijs om de ontwikkeling van embryo's te vertragen. Bereid de naald voor door aan een capillair glas te trekken met behulp van een micropipettrekker zoals beschreven in het teksthandschrift.Slijp de naaldpunt met behulp van een micromolen tot een punt met scherpe randen. Bereid injectieoplossingen voor door twee microliter gecommercialiseerd Cas9-eiwit en sgRNA toe te voegen aan RNace-vrij water in een PCR-buis om een volumemengsel van 10 microliter te verkrijgen. Meng goed door te pipetteren en leg het op ijs.Stel de parameters van de elektronische micro-injector in. Laad twee microliter van het mengsel in een naald met behulp van een pipetpunt van de microlader, waarbij zoveel mogelijk restlucht in de punt van de naald wordt afgevoerd. Sluit de injectienaald aan op een micromanipulator en zorg voor een nauwe verbinding tussen de twee delen.Plaats een dia in een petrischaaltje en leg het op het podium van de microscoop. Steek de naaldpunt voorzichtig in de bovenste halve bol van een embryo in een hoek van 45 graden. Druk op het pedaal om het mengsel in het embryo af te geven, wat leidt tot een lichte uitbreiding van het embryo.Trek de naald onmiddellijk van het embryo en beweeg de petrischaal met één hand totdat het volgende embryo zich in de buurt van de naald bevindt. Injecteer ten minste 300 embryo's met dezelfde procedure om ervoor te zorgen dat er voldoende uitkomt. Dek het deksel van de petrischaaltjes af na injectie.Wanneer de oppervlaktekleur van embryo's donkerder is geworden, plaatst u kunstmatige voeding in de petrischaal rond de microscoopglaasjes. Bereid 24-well kweekplaten en vul elke put tot 1/3 van zijn volumetrische capaciteit met kunstmatig dieet. Kies de broedende larve uit met een klein verfkwasttje en breng ze over naar de 24-well kweekplaat, zodat één put één larve heeft.Wanneer larven groeien naar het derde instar-stadium, breng ze dan over naar een nieuw glazen ductiel ethrae. Breng de nieuw ingesloten G-zero mannelijke volwassenen en wilde vrouwelijke volwassenen over in een verse netkooi met een gelijke verhouding. Voorzie ze van 10% suikeroplossing die in wattenbollen is gevallen.Kweek insecten met behulp van routinematige methoden tot de verpopping van G-one. Gebruik een tang om voorzichtig een achterpoot te verwijderen en plaats elk been in een Lysing Matrix-buis. Homogeniseer het achterbeen met behulp van een weefselhomogenisator.Extraheer het genomische DNA van het gehomogeniseerde monster met behulp van een commerciële gDNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Versterk het gensegment met behulp van genotyperingsprimers en de PCR-reactiecondities uit het teksthandschrift. Bevestig het genotype met een gen-sequencingservice.Zet G-one individuen van hetzelfde genotype in één netkooi, kruis zelf de G-one nakomelingen en blijf screenen met dezelfde methoden. De doelplaats van het interessante gen bevond zich in zijn tweede exon. Deze site was zeer geconserveerd en het doelbandfragment van gesynthetiseerd sgRNA werd bevestigd met behulp van agarosegel-elektroforese.De mutante detectie van een enkel sgRNA-doelwit werd uitgevoerd door de PCR-producten van G-one-ouderlijke eenheden te sequentiëren. De effectiviteit van het gebruik van niet-overlappende sgRNA-paren over verschillende exonen werd aangetoond omdat de grote deletie van de mutanten gemakkelijk te onderscheiden was van de wild-type pannen. Na het verkrijgen van een bepaald aantal mutante individuen, kunnen elektrofysiologische of gedragsexperimenten worden uitgevoerd om de genfunctie en interactie tussen verschillende genen te verduidelijken.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

De opeenvolgende Steegjes Test van angst bij muizen en ratten

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Knaagdieren Brain Micro-injectie om te studeren Molecular substraten van gemotiveerd gedrag

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

Holistische Facial Composite Creatie en Latere Video Line-up Eyewitness Identificatie Paradigm

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

Implantatie en Registratie van Wireless electroretinogram en Visual opgewekte potentiele in Conscious Rats

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulatie van Epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) en Sleep bij ratten en muizen door Acupunctuur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

Task Interruption en Hervatting paradigma voor het testen van de activering en de uitoefening van een abstract denken Goal

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methoden voor het koppelen en het onderhoud van de Pair van Nieuw-Zeeland witte konijnen (Oryctolagus Cuniculus) Via gedrags Ethogram, Monitoring, en interventies

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

Gedrags Tracking en Neuromast beeldvorming van Mexicaanse Cavefish

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcraniële gelijkstroom stimulatie (tDCS) van de gebieden van Wernicke en Broca in studies naar taalverwerving en woord overname

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...