Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31725023, 31861133019 ל- GW, 31171912 ל- CY).

1. עיצוב פריימרים ספציפיים לגן והכנת sgRNA
<ol><li>אמת אזור גנומי שמור בגן העניין באמצעות הגברת PCR וניתוחי רצף. הגבר את גן המטרה מהדנ"א הגנומי של H. armigera והבדיל בין האקסונים והאינטרונים. הערה: הספציפיות של הרצף של אתר המדריך נחוצה כדי למנוע עריכת גנים מחוץ למטרה. חיפוש אתרי מדריך אפשריים אקס...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems.">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944 (2020).</li><li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science:+Current+status,+future+perspectives,+and+associated+challenges.">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li><li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

היישום של מערכת CRISPR/Cas9 סיפק תמיכה טכנית רבת עוצמה לניתוח תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים. הפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן מדגים את הדור של מוטציה הומוזיגוטה ב H. armigera באמצעות עריכת גנום CRISPR / Cas9. הליך אמין זה מספק דרך פשוטה עבור mutagenesis גנים מכוונים ב H. armigera.
ה?...

היישום של טכנולוגיית עריכת הגנום מספק כלי יעיל להשגת מוטציות גן יעד במינים מגוונים. הופעתה של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצות באופן קבוע (CRISPR)/חלבון קשור 9 (Cas9) מספקת שיטה חדשנית לתפעול הגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכבת מ-RNA מדריך (gRNA) ו-Cas9 endonuclease2,3, בעוד שניתן לחלק עוד יותר את ה-gRNA לשני חלקים, RNA CRISPR משלים מטרה (crRNA) וקרנ"א טרנס-הפעלה (tracrRNA). ה- gRNA משתלב עם אנדונוקלאז Cas9 ויוצר ריבונוקלאופרוטאין (RNP). עם gRNA, ניתן להפנות אנדונוקלאז Cas9 לאתר מסוים של הגנום באמצעות השלמת בסיס. תחומי RuvC ו- HNH של ה- Cas9 מבקעים את אתר היעד של הגנום שלושה בסיסים לפני רצף המוטיב הסמוך לפרוטו-חלל (PAM) ויוצרים הפסקה כפולת גדילים (DSB). לאחר מכן ניתן לתקן את מחשוף ה- DNA באמצעות שני מנגנונים, צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)4. תיקון של DSB מציג הוספות או מחיקות כדרך להשבית את הגן הממוקד, שעלול לגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. לפיכך, הגילוי והספציפיות של מערכת CRISPR/Cas9 הופכים אותה לשיטה חזקה לאפיון פונקציות גנים ב- vivo ולניתוח אינטראקציות גנים5.
עם יתרונות רבים, מערכת CRISPR/Cas9 יושמה בתחומים שונים, כולל ביו-רפואה6,7, טיפול גנטי8,9 וחקלאות10,11,12, ושימשה למערכות ביולוגיות שונות כולל מיקרואורגניזמים13, צמחים14,15, נמטודות16 , ויונקים17 . אצל חסרי חוליות, מינים רבים של חרקים נחשפו לעריכת גנום CRISPR/Cas9, כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster ומעבר ל-18,19,20,20,21,22.
ארמיגרה הליקוברפה הוא אחד המזיקים ההרסניים ביותר ברחבי העולם23, ופוגע ביבולים רבים, כולל כותנה, פולי סויה וסורגום24,25. עם התפתחות טכנולוגיית הרצף, הגנום של H. armigera, כמו גם של מגוון של מיני חרקים לפידופטרה, כבר רצף לחלוטין 26,27,28,29. מספר רב של גנים של התנגדות קולטן חוש הריח זוהו ואופיינו מחרקים אלה בשנים האחרונות19,27,28,29. כמה גנים הקשורים להתנגדות זוהו H. armigera, כגון קידוד הגנים עבור cadherin30, טרנספורטר קלטות מחייב ATP31,32, כמו גם HaTSPAN133. נוקאאוט של גנים אלה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 גורם לרמה גבוהה של עמידות לרעלן Bacillus thuringiensis (BT) בזנים רגישים. כמו כן, צ'אנג ואח ' (2017) דפק את קולטן פרומון, אשר אימת את תפקידו המשמעותי ברגולציה זמן ההזדווגות19. דיווחים אלה מצביעים על כך ש-CRISPR/Cas9 יכול לשמש ככלי יעיל לחקר תפקוד הגנים במערכות חרקים. עם זאת, הליך מפורט לשינוי CRISPR/Cas9 במערכות החרקים נותר לא שלם, מה שמגביל את טווח היישום שלו בגנומיקה תפקודית של חרקים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפלת גן פונקציונלי ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. פרוטוקול מפורט מפורט שלב אחר שלב מסופק, כולל תכנון והכנה של פריימרים ספציפיים לגן לייצור gRNA, איסוף עוברים, מיקרו-חדירה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות. פרוטוקול זה משמש התייחסות בעלת ערך למניפולציה של כל הגנים התפקודיים ב - H. armigera וניתן להרחיבו למינים אחרים של לפידופטרה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

תולעת הכותנה, הליקוברפה ארמיגרה, היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. שילוב של גנטיקה מולקולרית, פיזיולוגיה, גנומיקה תפקודית ומחקרים התנהגותיים הפך את H. armigera למין מודל ב- Lepidoptera Noctuidae. כדי לחקור את הפונקציות in vivo של ואינטראקציות בין גנים שונים, מקובצים באופן קבוע interspaceed חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/ הקשורים חלבון 9 (Cas9) טכנולוגיית עריכת גנום היא שיטה נוחה ויעילה המשמשת לביצוע מחקרים גנומיים פונקציונליים. במחקר זה, אנו מספקים שיטה שיטתית שלב אחר שלב כדי להשלים נוקאאוט גנים ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. העיצוב והסינתזה של מדריך RNA (gRNA) מתוארים בפירוט. לאחר מכן, השלבים הבאים המורכבים מתכנון פריימר ספציפי לגנים ליצירת RNA מדריך (gRNA), איסוף עוברים, מיקרו-גירוי, גידול חרקים וזיהוי מוטציות מסוכמים. לבסוף, עצות והערות לפתרון בעיות מסופקות כדי לשפר את היעילות של עריכת גנים. השיטה שלנו תשמש התייחסות ליישום של עריכת גנום CRISPR / Cas9 ב H. armigera , כמו גם עשים אחרים Lepidopteran.

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים להשגת קווי נוק-אאוט גנטיים של H. armigera באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. התוצאות הייצוגיות שהושגו על ידי פרוטוקול זה מסוכמות עבור בחירת gDNA, איסוף עוברים והזרקה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות.
במחקר זה, אתר היעד של ג...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

תולעת כותנה היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. עריכת גנום עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאפשרת מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים באורגניזם זה. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי יש לו ספציפיות גבוהה והוא כופר.על מנת לבחור את מטרות sgRNA, עבור אל אתר האינטרנט המקוון CRISPR כדי לחפש אתרי מדריך אפשריים ואת exons קרוב חמשת האזורים העיקריים של הגן. הזן את רצף האקסון בתיבת הטקסט ובחר את גנום היעד לארמיגורה הליקוברפה. בחר באפשרות PAM עבור 20 BPNGG והשאר את ההגדרות האחרות בפרמטרי ברירת המחדל, בהתאם למדריכי המשתמש של אתר האינטרנט.השווה את רצפי המדריכים החזויים מהתוכנה ובחר רצף מדריך של 20 זוגות בסיסים המכילים גואניס אחד או שניים ליד חמשת האזורים הלא מתווספים העיקריים עם היעילות החזויה הגבוהה ביותר והמעט ביותר אי-התאמות כדי לשפר את יעילות העריכה ולהפחית את העריכה מחוץ ליעד. להכנת עוברים, בחרו 50 אנשים בריאים מזכרים בני שלושה ימים ונקבות בנות יומיים, וערבבו אותם בכלוב רשת נקי. מניחים חתיכת כותנה לחה המכילה 10% תמיסת סוכר בכלוב.לכסות את כלובי הרשת עם גזה ולתקן את הגזה עם גומייה. לרסס מים על הגזה כדי לשמור אותו לח. חותכים מטלית שחורה לגודל מתאים והחליפו את הגזה הלחה במטלית שחורה זו כדי לאפשר תנוחת ביציות חופשית למשך 30 דקות.הדבק סרט דו-צדדי על שקופית מיקרוסקופ. בעזרת מלקחיים, הדבק את הטלאים בביצים בשורה על פני השטח של הסרט הדו-צדדי. הקש על השוליים של כל תיקון כדי לוודא שהם נדבקים בחוזקה לקלטת.לאסוף 50 עד 100 ביצים לכל שקופית מיקרוסקופ. לפני המיקרו-הנדסה, שמור את החלקת המיקרוסקופ על הקרח כדי לעכב את התפתחות העוברים. הכן את המחט על ידי משיכת זכוכית נימית באמצעות משיכת מיקרו פיפטה כמתואר בכתב היד של הטקסט.טוחנים את קצה המחט באמצעות מטחנת מיקרו לקצה חד. הכן פתרונות הזרקה על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של חלבון Cas9 ממוסחר ו- sgRNA למים נטולי RNace בצינור PCR כדי לקבל תערובת נפח של 10 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי צנרת ולשים אותו על קרח.הגדר את הפרמטרים של המיקרו-מגרר האלקטרוני. טען שני microliters של התערובת לתוך מחט באמצעות קצה פיפטה microloader, מתיש כמה שיותר אוויר שיורית בקצה המחט ככל האפשר. חבר את מחט ההזרקה למיקרו-מניפולטור והבטח חיבור הדוק בין שני החלקים.מניחים שקופית בצלחת פטרי ומניחים אותה על הבמה של המיקרוסקופ. הכנס בזהירות את קצה המחט לחצי הכדור העליון של עובר בזווית של 45 מעלות. לחץ על הדוושה כדי להעביר את התערובת לתוך העובר, מה שמוביל להתרחבות קלה של העובר.מוציאים את המחט מיד מהעובר ומזיזים את צלחת הפטרי ביד אחת עד שהעובר הבא נמצא בסמיכות למחט. הזריקו לפחות 300 עוברים באמצעות אותו הליך כדי להבטיח כמות בקיעה מספקת. מכסים את המכסה של צלחות פטרי לאחר הזרקה.כאשר צבע פני השטח של העוברים החשיך, לשים דיאטה מלאכותית בצלחת פטרי סביב שקופית המיקרוסקופ. הכינו צלחות תרבית של 24 בארות ומלאו כל באר עד שליש מקיבולת נפחיותה בתזונה מלאכותית. בחרו זחלים בוקעים באמצעות מברשת צבע קטנה והעבירו אותם לצלחת התרבות של 24 בארות, כך שלבאר אחת יש זחל אחד.כאשר הזחלים גדלים לשלב האינסטאר השלישי, העבירו אותם לאתרה רקיע זכוכית חדש. העבירו את זכרי הג'י-זירו שזה עתה נסגרו ואת הנקבות המבוגרות הפראיות לכלוב רשת טרי ביחס שווה. ספק להם תמיסת סוכר של 10% שהושלכה בכדורי כותנה.חרקים אחוריים באמצעות שיטות שגרתיות עד הגור של G-אחד. השתמש מלקחיים כדי להסיר בזהירות רגל אחורית ולשים כל רגל בצינור מטריקס Lysing. הומוגניזציה של הרגל האחורית באמצעות הומוגניזר רקמות.לחלץ את ה- DNA הגנומי של המדגם הומוגני באמצעות ערכת מיצוי gDNA מסחרית על פי הוראות היצרן. הגבר את מקטע הגנים באמצעות פריימרים genotyping ותנאי תגובת PCR מכתב היד של הטקסט. אשר את הגנוטיפ באמצעות שירות רצף גנים.שים G-אחד אנשים של אותו genotype בכלוב רשת אחד, עצמי לחצות את הצאצאים G-אחד ולהמשיך לסנן באמצעות אותן שיטות. אתר היעד של גן העניין היה ממוקם האקסון השני שלה. אתר זה נשמר מאוד ורסיס רצועת היעד של sgRNA מסונתז אושר באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose.זיהוי המוטציה של יעד sgRNA יחיד בוצע על ידי ריצוף מוצרי PCR מיחידות הוריות G-אחד. האפקטיביות של שימוש בזוגות sgRNA שאינם חופפים על פני אקסונים שונים הודגמה כאשר המחיקה הגדולה של המוטנטים נבדלה בקלות מהמחבתות הפראיות. לאחר קבלת מספר מסוים של אנשים מוטנטיים, ניתן לבצע ניסויים אלקטרופיזיולוגיים או התנהגותיים כדי להבהיר את תפקוד הגנים ואת האינטראקציה בין גנים שונים.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

מבחן הסמטאות הרצוף של חרדה בעכברים וחולדות

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

יצירה הוליסטית פנים Composite ולאחר וידאו קו-עד הראייה זיהוי פרדיגמה

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

השרשה ורישום האלחוטי electroretinogram ופוטנציאל חזותי מעורר אצל חולדות Conscious

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

מניפולציה של Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) ולישון חולדות ועכברים ידי דיקור

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

הפרעה משים ואת פרדיגמה חידוש לבדיקת ההפעלה וחיפוש אחר מטרת חשיבה מופשטת

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

שיטות של זיווג ותחזוקה זוג של ניו זילנד הלבן ארנבים (Oryctolagus Cuniculus) ויה Ethogram התנהגותית, ניטור, והתערבויות

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

מעקב אחר התנהגות והדימות Neuromast של Cavefish מקסיקני

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct הגירוי הנוכחי (tDCS) של האזורים של ורניקה וברוקה במחקרים של לימוד שפה ורכישת מילים

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...