Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(31725023、GW 31861133019、31171912 CY)の支援を受けた。

1. 遺伝子特異的プライマーの設計とsgRNAの作製
<ol><li>目的の遺伝子内の保存されたゲノム領域を、PCR 増幅およびシーケンシング解析によって検証します。 H. armigera のゲノムDNAから標的遺伝子を増幅し、エクソンとイントロンを区別する。 注:ガイド部位の配列特異性は、オフターゲット遺伝子編集を避けるために必要です。エクソン中の探索可能なガイド部位は、遺伝子の5'UTRに近...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. 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A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. 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A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. 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K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

CRISPR/Cas9システムの適用は、遺伝子機能や様々な遺伝子間の相互作用の解析に強力な技術サポートを提供してきました。ここで提示する詳細なプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集による H. armigera におけるホモ接合体変異体の生成を実証する。この信頼性の高い手順は、 H. armigeraにおける指向性遺伝子突然変異誘発のための簡単な方法を提供する。
CRISPR標的部...

ゲノム編集技術の応用は、多様な種において標的遺伝子変異体を達成するための効率的なツールを提供する。クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)システムの出現は、ゲノムを操作するための新しい方法を提供します1。CRISPR/Cas9システムはガイドRNA(gRNA)とCas9エンドヌクレアーゼ2,3からなり、gRNAはさらに標的相補的なCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)の2つの部分に分けることができます。gRNAはCas9エンドヌクレアーゼと統合し、リボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。gRNAを用いると、Cas9エンドヌクレアーゼを塩基相補を介してゲノムの特定の部位に導くことができる。Cas9のRuvCドメインとHNHドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の3塩基前にゲノムの標的部位を切断し、二本鎖切断(DSB)を作り出します。DNA切断は、非相同末端結合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)4の2つのメカニズムを介して修復することができる。DSBの修復は、標的遺伝子を不活性化する方法として挿入または欠失を導入し、潜在的に遺伝子機能の完全な喪失を引き起こす。したがって、CRISPR/Cas9システムの遺伝性と特異性により、CRISPR/Cas9システムは、生体内の遺伝子機能を特徴付け、遺伝子相互作用を分析するための堅牢な方法となっています5。
CRISPR/Cas9システムは、多くのメリットにより、生物医学6,7、遺伝子治療8,9、農業10,11,12など様々な分野に応用され、微生物13、植物14,15、線虫16、哺乳類17を含む様々な生物系に利用されています。.無脊椎動物では、ショウジョウバエのメラノガスターなど、多くの昆虫種がCRISPR/Cas9ゲノム編集を受けています18,19,20,21,22。
ヘリコバーパ・アルミゲラは世界で最も破壊的な害虫の1つであり23、綿花、大豆、ソルガムなど数多くの作物に被害を与えています24,25。シーケンシング技術の発展に伴い、H. armigeraのゲノム、ならびに鱗翅目昆虫種の範囲のゲノムが完全に配列決定されました26,27,28,29。近年、これらの昆虫から多数の耐性および嗅覚受容体遺伝子が同定され、特徴付けられている19、27、28、29。いくつかの耐性関連遺伝子は、カドヘリン30、ATP結合カセットトランスポーター31、32、ならびにHaTSPAN133をコードする遺伝子など、H. armigeraにおいて同定されている。CRISPR/Cas9技術を用いたこれらの遺伝子のノックアウトは、感受性株におけるバチルス・チューリンゲンシス(BT)毒素に対する高レベルの耐性をもたらす。また、Chang et al. (2017)はフェロモン受容体をノックアウトし、交配時間調節におけるその有意な機能を検証した19。これらの報告は、CRISPR/Cas9が昆虫系における生体内の遺伝子機能を研究するための効果的なツールとして作用し得ることを示唆している。しかしながら、昆虫系におけるCRISPR/Cas9改変の詳細な手順は不完全なままであり、昆虫機能ゲノミクスにおけるその適用範囲が制限されている。
ここでは、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の機能遺伝子をノックアウトするためのプロトコルを提示する。gRNA産生、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、および変異同定のための遺伝子特異的プライマーの設計および調製を含む、詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。このプロトコルは、 H. armigera の機能遺伝子を操作するための貴重な参照として機能し、他の鱗翅目種に拡張することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

コットンボールワーム、 ヘリカバーパアルミゲラは、世界で最も破壊的な害虫の1つです。分子遺伝学、生理学、機能ゲノミクス、行動研究の組み合わせにより、 H. armigera は鱗翅目Noctuidaeのモデル種となっています。異なる遺伝子間の相互作用のインビボ機能を研究するために、クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)ゲノム編集技術は、機能的ゲノム研究を行うために使用される便利で効果的な方法である。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の遺伝子ノックアウトを段階的に体系的に完了させる方法を提供する。ガイドRNA(gRNA)の設計および合成について詳細に説明する。次に、ガイドRNA(gRNA)作成のための遺伝子特異的プライマー設計、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、変異体検出からなるその後の工程をまとめる。最後に、遺伝子編集の効率を向上させるためのトラブルシューティングのアドバイスとメモが提供されています。我々の方法は、 H. armigera および他の鱗翅目の蛾におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集の適用のための参照として役立つであろう。

このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術を用いて H. armigera の遺伝子ノックアウト株を取得するための詳細な手順を提供する。このプロトコールによって得られた代表的な結果は、gDNA選択、胚採取および注入、昆虫飼育、および変異体検出について要約される。
本研究では、我々の目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソ...

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Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera (Hübner)胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定のプロトコルを紹介します。変異昆虫は、生体内の異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用のさらなる研究を可能にする。

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

コットンボルワームは世界で最も破壊的な害虫の1つです。CRISPR/Cas9技術によるゲノム編集により、この生物の遺伝子機能や遺伝子間の相互作用をさらに研究することができます。この技術の2つの主な利点は、それが高い特異性を有し、遺伝可能であることである。sgRNA標的を選択するには、CRISPRオンラインWebサイトにアクセスして、可能なガイドサイトと遺伝子の5つの主要な非翻訳領域に近いエクソンを検索します。テキストボックスにエクソン配列を入力し、ヘリコベルパ・アルミゲラの標的ゲノムを選択します。20 BPNGGのPAMオプションを選択し、ウェブサイトのユーザーマニュアルに従って、デフォルトのパラメータに他の設定を残します。ソフトウェアから予測されたガイドシーケンスを比較し、予測効率が最も高く、ミスマッチが最も少ない5つのプライム非翻訳領域の近くに1つまたは2つのグアニンを含む20塩基対のガイドシーケンスを選択して、編集効率を向上させ、オフターゲット編集を削減します。胚調製のために、3日齢の男性と2日齢の女性から50人の健常者を選択し、それらをきれいなネットケージに混ぜる。10%砂糖溶液を含む湿った綿片をケージに入れます。ネットケージをガーゼで覆い、ガーゼを輪ゴムで固定します。ガーゼに水をスプレーして湿らせます。黒い布を適切な大きさにカットし、湿ったガーゼをこの黒い布と交換して、30分間自由な卵子の位置を可能にします。顕微鏡スライドに両面テープを貼り付けます。鉗子を使用して、両面テープの表面に卵の入ったパッチを一列に貼り付けます。各パッチの余白を押して、テープにしっかりとくっついていることを確認します。顕微鏡スライドあたり50〜100個の卵を集める。マイクロインジェクションの前に、顕微鏡を氷の上にスライドさせて胚の発生を遅らせてください。本文原稿に記載されているようにマイクロピペットプーラーを用いてキャピラリーガラスを引っ張って針を準備する。マイクログラインダーを使用して針先を鋭利な先端に研削します。PCRチューブ内のRNaceフリー水に市販のCas9タンパク質とsgRNAの2マイクロリットルを加えて注射液を調製し、10マイクロリットルの容量混合物を得た。ピペッティングでよく混ぜて氷の上に置きます。電子マイクロインジェクタのパラメータを設定します。マイクロローダーピペットチップを使用して2マイクロリットルの混合物を針にロードし、ニードルの先端にできるだけ多くの残留空気を排出する。注射針をマイクロマニピュレーターに接続し、2つの部品をしっかりと接続します。スライドをペトリ皿に置き、顕微鏡のステージに置きます。針先を胚の上半球に45度の角度で慎重に挿入する。ペダルを押して混合物を胚に送り込み、胚のわずかな膨張をもたらす。胚からすぐに針を引っ込め、次の胚が針に接するまで片手でペトリ皿を動かします。十分な孵化量を確保するために、同じ手順を用いて少なくとも300個の胚を注入する。注射後にペトリ皿の蓋を覆う。胚の表面色が暗くなったら、顕微鏡スライドの周りのペトリ皿に人工飼料を入れます。24穴培養プレートを用意し、各ウェルを体積容量の1/3まで人工飼料で満たします。小さなペイントブラシを使用して孵化幼虫を選び出し、1つの井戸に1つの幼虫が1匹いるように、それらを24ウェル培養プレートに移す。幼虫が第3齢期に成長したら、それらを新しいガラス延性エトラエに移す。新しく封入されたG-zeroオス成虫と野生型雌成虫を、同じ比率で新鮮なネットケージに移す。綿球に落とした10%砂糖溶液を彼らに供給します。G-oneの蛹化まで日常的な方法を用いて昆虫を後方にする。鉗子を使用して後肢を慎重に取り除き、各脚をライシングマトリックスチューブに入れます。組織ホモジナイザーを使用して後肢を均質化する。ホモジナイズされた試料のゲノムDNAを、製造元の指示に従って市販のgDNA抽出キットを用いて抽出する。テキスト原稿からジェノタイピングプライマーおよびPCR反応条件を用いて遺伝子セグメントを増幅する。遺伝子シーケンシングサービスで遺伝子型を確認します。同じ遺伝子型のG-one個体を1つのネットケージに入れ、G-one子孫を自己横断し、同じ方法を用いてスクリーニングを継続する。目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソンに位置していた。この部位は高度に保存され、合成されたsgRNAの標的バンド断片をアガロースゲル電気泳動を用いて確認した。単一のsgRNA標的の変異体検出は、G-one親ユニットからのPCR産物を配列決定することによって行った。異なるエクソン間で重複しないsgRNAペアを使用することの有効性は、変異体の大きな欠失が野生型パンと容易に区別されるため、実証された。一定数の変異個体を得た後、電気生理学的または行動学的実験を行い、異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用を明らかにすることができる。

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

マウスおよびラットにおける不安の連続路地テスト

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

ホリスティックフェイシャルコンポジットの作成とその後のビデオ・ラインアップ目撃者識別パラダイム

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

覚醒ラットに移植し、無線電図の記録と視覚誘発電位

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

鍼治療によりラットとマウスにおけるてんかんElectrocorticograms（ECoGs）の操作とスリープ

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

抽象的思考ゴールの活性化と追求をテストするためのタスクの中断と再開のパラダイム

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

ペアリングの方法とペア メンテナンス ニュージーランドの白のウサギ (テクニック)監視、行動の Ethogram を介してと介入

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

行動追跡とメキシコの血脈の Neuromast イメージング

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

言語学習と単語習得の研究におけるヴェルニッケとブロカの領域の経頭蓋直流刺激(tDCS)

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

CRISPR/Cas9ゲノム編集ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定