Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW, og 31171912 til CY).

1. Design av genspesifikke primere og fremstilling av sgRNA
<ol><li>Verifiser en bevart genomisk region i genet av interesse gjennom PCR-forsterknings- og sekvenseringsanalyser. Forsterk målgenet fra genom-DNA-et til H. armigera og skille eksoner og introner. MERK: Sekvensspesifikkiteten til guidesiden er nødvendig for å unngå ekstern genredigering. Søk mulige guidesider i exons er nær 5 ' UTR av genet. Deretter er det viktig å sørge for at genet er helt ikke-fungerende. Et sammendrag av strømnings...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems.">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944 (2020).</li><li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science:+Current+status,+future+perspectives,+and+associated+challenges.">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li><li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

Anvendelsen av CRISPR/Cas9-systemet har gitt kraftig teknisk støtte til analyse av genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener. Den detaljerte protokollen vi presenterer her demonstrerer genereringen av en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR / Cas9 genomredigering. Denne pålitelige prosedyren gir en enkel måte for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget av CRISPR-målsider kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokollen samme...

Anvendelsen av genomredigeringsteknologi gir et effektivt verktøy for å oppnå målgenmutanter i forskjellige arter. Fremveksten av det klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / assosiert protein 9 (Cas9) systemet gir en ny metode for å manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består av en guide RNA (gRNA) og Cas9 endonuclease2,3, mens gRNA kan videre deles inn i to deler, et mål komplementær CRISPR RNA (crRNA) og en transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA integreres med Cas9 endonuclease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA kan Cas9 endonuclease rettes til et bestemt sted for genomet via base komplementering. RuvC- og HNH-domenene til Cas9 cleave målstedet til genomet tre baser før protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens og skape en dobbel-strand pause (DSB). DNA-spaltingen kan deretter repareres gjennom to mekanismer, ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR)4. Reparasjon av DSB introduserer innsettinger eller slettinger som en måte å inaktivere det målrettede genet på, noe som potensielt kan føre til et fullstendig tap av genfunksjon. Derfor gjør den arvelige og spesifisiteten til CRISPR/Cas9-systemet det til en robust metode for å karakterisere genfunksjoner in vivo og analysere geninteraksjoner5.
Med mange fordeler har CRISPR/Cas9-systemet blitt brukt på ulike felt, inkludert biomedisin6,7, genterapi8,9 og landbruk10,11,12, og har blitt brukt til ulike biologiske systemer, inkludert mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . I hvirvelløse dyr har mange insektarter blitt utsatt for CRISPR / Cas9 genomredigering, for eksempel fruktfluen Drosophila melanogaster og utover 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er en av de mest destruktive over hele verden23, og skader mange avlinger, inkludert bomull, soyabønner og sorghum24,25. Med utviklingen av sekvenseringsteknologi har genomet til H. armigera, så vel som for en rekke Lepidoptera insektarter, blitt sekvensert helt26,27,28,29. Et stort antall resistens- og olfaktoriske reseptorgener har blitt identifisert og karakterisert fra disse insektene de siste årene19,27,28,29. Noen resistensrelaterte gener er identifisert i H. armigera, for eksempel genkoding for kadherin30, en ATP-bindende kassetttransportør31,32, samt HaTSPAN133. Knockout av disse genene ved hjelp av CRISPR/ Cas9-teknologi resulterer i et høyt nivå av motstand mot Bacillus thuringiensis (BT) toksin i mottakelige stammer. Chang et al. (2017) slo også ut en feromonreseptor, som validerte sin betydelige funksjon i parringstidsregulering19. Disse rapportene tyder på at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt verktøy for å studere genfunksjon in vivo i insektsystemer. Imidlertid forblir en detaljert prosedyre for CRISPR / Cas9-modifikasjon i insektsystemer ufullstendig, noe som begrenser bruksområdet i insektfunksjonell genomikk.
Her presenterer vi en protokoll for å slå ut et funksjonelt gen i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. En detaljert trinnvis protokoll er gitt, inkludert design og forberedelse av genspesifikke primere for gRNA-produksjon, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantidentifikasjon. Denne protokollen fungerer som en verdifull referanse for å manipulere eventuelle funksjonelle gener i H. armigera og kan utvides til andre Lepidoptera-arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

Bomullsbollworm, Helicoverpa armigera, er en av de mest destruktive i verden. En kombinasjon av molekylær genetikk, fysiologi, funksjonell genomikk og atferdsstudier har gjort H. armigera til en modellart i Lepidoptera Noctuidae. For å studere in vivo-funksjonene til og interaksjoner mellom forskjellige gener, er gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/ assosiert protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode som brukes til å utføre funksjonelle genomiske studier. I denne studien tilbyr vi en trinnvis systematisk metode for å fullføre gen knockout i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Design og syntese av guide RNA (gRNA) er beskrevet i detalj. Deretter oppsummeres de påfølgende trinnene som består av genspesifikk primerdesign for RNA (gRNA) opprettelse, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantdeteksjon. Til slutt gis feilsøkingsråd og notater for å forbedre effektiviteten av genredigering. Vår metode vil fungere som en referanse for anvendelsen av CRISPR / Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møll.

Denne protokollen gir detaljerte trinn for å skaffe genutslagslinjer av H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-teknologi. De representative resultatene oppnådd av denne protokollen er oppsummert for gDNA-utvalg, embryosamling og injeksjon, insektoppdrett og mutantdeteksjon.
I denne studien var målstedet for vårt gen av interesse lokalisert i sin andre exon (figur 2A). Dette nettstedet v...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÂ¼bner at JoVE.com

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

Presentert her er en protokoll av Helicoverpa armigera (Hübner) embryo mikroinjeksjon og knockout mutant identifikasjon opprettet av CRISPR / Cas9 genom redigering. Mutante insekter muliggjør videre forskning på genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener in vivo.

Embryomikroinjeksjon og knockout mutant identifikasjon av CRISPR/Cas9 Genom-redigert Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Bomullsbollworm er en av de mest destruktive over hele verden. Genomredigering med CRISPR/Cas9-teknologien muliggjør videre forskning på genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener i denne organismen. De to viktigste fordelene med denne teknikken er at den har høy spesifisitet og er arvelig.For å velge sgRNA-målene, gå til CRISPRs nettsted for å søke etter mulige guidesider og exons nær den fem viktigste uoversatte regionen av genet. Skriv inn eksonsekvensen i tekstboksen, og velg målgenomet til Helicoverpa armigera. Velg PAM-alternativet for 20 BPNGG og la de andre innstillingene være på standardparametrene, i henhold til brukerhåndbøkene til nettstedet.Sammenlign de predikerte guidesekvensene fra programvaren og velg en guidesekvens med 20 basispar som inneholder en eller to guaniner i nærheten av det fem primære uoversatte området med den høyeste forventede effektiviteten og færrest uoverensstemmelser for å forbedre redigeringseffektiviteten og redusere off-target redigering. For embryoforberedelse, velg 50 friske individer fra tre dager gamle menn og to dager gamle kvinner, og bland dem i et rent nettbur. Legg et stykke fuktig bomull som inneholder 10% sukkeroppløsning i buret.Dekk nettburene med gasbind og fest gasbindet med et gummibånd. Spray vann på gasbindet for å holde det fuktig. Klipp en svart klut i riktig størrelse og erstatt den fuktige gasbindet med denne svarte kluten for å muliggjøre fri rognposisjon i 30 minutter.Lim inn tosidig tape på et mikroskoplysbilde. Bruk tang, lim med egg på rad på overflaten av det dobbeltsidige båndet. Trykk på margen på hver patch for å sikre at de fester seg godt til båndet.Samle 50 til 100 egg per mikroskop lysbilde. Før mikroinjeksjon, hold mikroskopet glidende på is for å forsinke utviklingen av embryoer. Forbered nålen ved å trekke i et kapillærglass ved hjelp av en mikropipettetrekker som beskrevet i tekstmanuskriptet.Slip nålespissen med en mikrokvern til en spiss med skarpe kanter. Forbered injeksjonsløsninger ved å tilsette to mikroliter kommersialisert Cas9-protein og sgRNA til RNace-fritt vann i et PCR-rør for å oppnå 10 mikrolitervolumblanding. Bland godt ved pipettering og legg det på is.Angi parametrene til den elektroniske mikroinjektoren. Legg to mikroliter av blandingen i en nål ved hjelp av en pipettespiss for mikrolaster, og utmatt så mye gjenværende luft i nålens spiss som mulig. Koble injeksjonsnålen til en mikromanipulator og sørg for en tett forbindelse mellom de to delene.Legg en glide i en Petri-tallerken og legg den på mikroskopets scene. Sett nålespissen forsiktig inn i den øverste halvkule av et embryo i en 45 graders vinkel. Trykk pedalen for å levere blandingen inn i embryoet, noe som fører til en liten utvidelse av embryoet.Trekk nålen umiddelbart tilbake fra embryoet og flytt Petri-parabolen med den ene hånden til neste embryo er i nærheten av nålen. Injiser minst 300 embryoer ved hjelp av samme prosedyre for å sikre tilstrekkelig klekkemengde. Dekk lokket på Petri-rettene etter injeksjon.Når overflatefargen på embryoer har mørknet, legg kunstig diett i Petri-parabolen rundt mikroskopet. Forbered 24-brønns kulturplater og fyll hver brønn til 1/3 av sin volumetriske kapasitet med kunstig kosthold. Plukk ut klekkelarve ved hjelp av en liten pensel og overfør dem til 24-brønns kulturplaten, slik at en brønn har en larve.Når larven vokser til den tredje instar-fasen, overfør dem til en ny glassduktil ethrae. Overfør de nylig lukkede G-null mannlige voksne og villtype kvinnelige voksne til et friskt nettobur med samme forhold. Forsyne dem med 10% sukkeroppløsning droppet i bomullskuler.Bakinsekter ved hjelp av rutinemetoder til pupering av G-en. Bruk tang for å forsiktig fjerne et bakben og legg hvert ben i et Lysing Matrix-rør. Homogeniser bakbenet ved hjelp av en vev homogenisator.Trekk ut det genomiske DNA-et til den homogeniserte prøven ved hjelp av et kommersielt gDNA-ekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner. Forsterk gensegmentet ved hjelp av genotypingprimere og PCR-reaksjonsforholdene fra tekstmanuskriptet. Bekreft genotypen med en gensekvenseringstjeneste.Sett G-en individer av samme genotype i ett nettbur, kryss selv G-en avkom og fortsett å screene ved hjelp av de samme metodene. Målstedet for genet av interesse var plassert i sin andre ekson. Dette nettstedet var svært konservert og målbåndfragmentet av syntetisert sgRNA ble bekreftet ved hjelp av agarose gel elektroforese.Mutantdeteksjonen av et enkelt sgRNA-mål ble utført ved å sekvensere PCR-produktene fra G-one foreldreenheter. Effektiviteten ved å bruke ikke-overlappende sgRNA-par på tvers av forskjellige eksoner ble demonstrert da den store slettingen av mutantene lett ble skilt fra de ville pannene. Etter å ha oppnådd et visst antall mutante individer, kan elektrofysiologiske eller atferdseksperimenter utføres for å avklare genfunksjon og interaksjon mellom forskjellige gener.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

Den påfølgende Alleys Test av angst hos mus og rotter

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Stereotaxic Mikroinjeksjon av Viral vektorer som uttrykker Cre rekombinase å studere rollen til målgener i Kokain Kondisjonert Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Gnager Brain Mikroinjeksjon å studere Molecular Underlag av motiverte Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

Holistisk Facial Composite Creation og Følgende Video Lagoppstilling Eyewitness Identification Paradigm

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

Implantasjon og opptak av Wireless elektroretinogrammet og Visual evoked potensial i bevisste rotter

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulering av epileptiske Electrocorticograms (ECoGs) og Sov i rotter og mus med akupunktur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

Task Avbrudd og Gjenopptagelse Paradigm for Teste Aktivering og jakten på en abstrakt tenkning Goal

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Metoder for sammenkobling og par vedlikehold av New Zealand hvit kanin (Oryctolagus Cuniculus) Via atferdsmessige Ethogram, overvåking, og tiltak

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

Atferdsmessige sporing og Neuromast avbildning av meksikanske Cavefish

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transkraniell direkte nåværende stimulering (tDCS) av Wernickes ' s og Broca ' s områder i studier av språklæring og Word Acquisition

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...