Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 à GW, e 31171912 à CY).

1. Projeto de primers específicos de genes e preparação de sgRNA
<ol><li>Verifique uma região genômica conservada no gene de interesse através de análises de amplificação e sequenciamento do PCR. Amplificar o gene alvo do DNA do genoma de H. armigera e distinguir os exons e introns. NOTA: A especificidade da sequência do site de guias é necessária para evitar a edição de genes fora do alvo. Pesquise possíveis locais-guia nos exons estão próximos do UTR de 5' do gene. Então, é importante t...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. 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A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

A aplicação do sistema CRISPR/Cas9 forneceu poderoso suporte técnico para a análise da função genética e interação entre vários genes. O protocolo detalhado que apresentamos aqui demonstra a geração de um mutante homozigoto em H. armigera via edição de genomas CRISPR/Cas9. Este procedimento confiável fornece uma maneira simples de mutagênese genética direcionada em H. armigera.
A escolha dos locais-alvo do CRISPR pode afetar a eficiência da <sup class="xref"...

A aplicação da tecnologia de edição de genomas fornece uma ferramenta eficiente para alcançar mutantes de genes-alvo em diversas espécies. O surgimento do sistema de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/proteína associada 9 (Cas9) fornece um novo método para manipular genomas1. O sistema CRISPR/Cas9 consiste em um RNA guia (gRNA) e o endonuclease Cas92,3, enquanto o gRNA pode ser ainda dividido em duas partes, um RNA CRISPR complementar de destino (crRNA) e um crRNA trans-ativante (tracrRNA). O gRNA se integra com a endonuclease Cas9 e forma uma ribonucleoproteína (RNP). Com o gRNA, o cas9 endonuclease pode ser direcionado para um local específico do genoma via complementação base. Os domínios RuvC e HNH do Cas9 têm o local alvo do genoma três bases antes da sequência protoespacial adjacente (PAM) e criam uma quebra de dois fios (DSB). O decote de DNA pode então ser reparado através de dois mecanismos, a junção final não homólogo (NHEJ) ou o reparo direcionado à e homologia (HDR)4. O reparo do DSB introduz inserções ou exclusões como forma de inativar o gene alvo, causando potencialmente uma perda completa da função genética. Assim, o herediável e a especificidade do sistema CRISPR/Cas9 fazem dele um método robusto para caracterizar funções genéticas in vivo e analisar interações genéticas5.
Com inúmeros méritos, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido aplicado a diversos campos, incluindo biomedicina6,7, terapia genética8,9 e agricultura10,11,12, e tem sido utilizado para vários sistemas biológicos, incluindo microrganismos13, plantas14,15, nematodes16 e mamíferos17 . Nos invertebrados, muitas espécies de insetos foram submetidas à edição do genoma CRISPR/Cas9, como a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e além de 18,19,20,21,22.
A helicoverpa armigera é uma das pragas mais destrutivas do mundo23, e danifica inúmeras culturas, incluindo algodão, soja e sorgo24,25. Com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento, o genoma de H. armigera, bem como o de uma gama de espécies de insetos Lepidoptera, foram sequenciados completamente26,27,28,29. Um grande número de genes de resistência e receptores olfativos foram identificados e caracterizados a partir desses insetos nos últimos anos19,27,28,29. Alguns genes relacionados à resistência foram identificados em H. armigera, como os genes codificados para cadherin30, um transporte de de ligação ATP31,32, bem como HaTSPAN133. O nocaute desses genes usando a tecnologia CRISPR/Cas9 resulta em um alto nível de resistência à toxina Bacillus thuringiensis (BT) em cepas suscetíveis. Além disso, Chang et al. (2017) derrubaram um receptor de feromônio, que validou sua função significativa na regulação do tempo de acasalamento19. Esses relatórios sugerem que o CRISPR/Cas9 pode atuar como uma ferramenta eficaz para estudar a função genética in vivo em sistemas de insetos. No entanto, um procedimento detalhado para a modificação crispr/cas9 em sistemas de insetos permanece incompleto, o que limita sua gama de aplicação em genômica funcional de insetos.
Aqui, apresentamos um protocolo para eliminar um gene funcional em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. Um protocolo passo-a-passo detalhado é fornecido, incluindo o projeto e a preparação de primers específicos de genes para produção de gRNA, coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e identificação de mutantes. Este protocolo serve como uma referência valiosa para manipular quaisquer genes funcionais em H. armigera e pode ser estendido a outras espécies de Lepidoptera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

O algodão bollworm, Helicoverpa armigera, é uma das pragas mais destrutivas do mundo. Uma combinação de genética molecular, fisiologia, genômica funcional e estudos comportamentais fez de H. armigera uma espécie modelo em Lepidoptera Noctuidae. Para estudar as funções in vivo e interações entre diferentes genes, agrupadas regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas (CRISPR)/ proteína associada 9 (Cas9) é um método conveniente e eficaz usado para a realização de estudos genômicos funcionais. Neste estudo, fornecemos um método sistemático passo a passo para completar o nocaute genético em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. O design e a síntese do guia RNA (gRNA) são descritos em detalhes. Em seguida, são resumidas as etapas subsequentes que consistem no projeto de primer específico de genes para criação de RNA guia (gRNA), coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e detecção de mutantes. Finalmente, conselhos e notas de solução de problemas são fornecidos para melhorar a eficiência da edição de genes. Nosso método servirá como referência para a aplicação da edição de genomas CRISPR/Cas9 em H. armigera , bem como outras mariposas lepidopteranas.

Este protocolo fornece etapas detalhadas para a obtenção de linhas de knock-out genéticas de H. armigera usando a tecnologia CRISPR/Cas9. Os resultados representativos obtidos por este protocolo são resumidos para seleção de GDNA, coleta e injeção de embriões, criação de insetos e detecção de mutantes.
Neste estudo, o local alvo do nosso gene de interesse foi localizado em seu segundo exon (<strong class="x...

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Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃƒÆ’Ã‚Â¼bner

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

O algodão bollworm é uma das pragas mais destrutivas do mundo. A edição de genomas com a tecnologia CRISPR/Cas9 permite mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes neste organismo. As duas principais vantagens dessa técnica são que ela tem alta especificidade e é herediável.Para escolher os alvos do sgRNA, acesse o site online do CRISPR para procurar possíveis sites-guia e os exons próximos às cinco principais regiões não traduzidas do gene. Insira a sequência de exon na caixa de texto e selecione o genoma alvo para a armigera Helicoverpa. Escolha a opção PAM para 20 BPNGG e deixe as outras configurações nos parâmetros padrão, de acordo com os manuais de usuário do site.Compare as sequências de guia previstas do software e escolha uma sequência guia de 20 pares de base contendo um ou dois guaninos perto da região não traduzida cinco prime com a maior eficiência prevista e menos incompatibilidades para melhorar a eficiência de edição e reduzir a edição fora do alvo. Para a preparação de embriões, selecione 50 indivíduos saudáveis de machos de três dias de idade e fêmeas de dois dias de idade, e misture-os em uma gaiola limpa. Coloque um pedaço de algodão úmido contendo solução de 10% de açúcar na gaiola.Cubra as gaiolas com gaze e conserte a gaze com um elástico. Borrife água na gaze para mantê-la úmida. Corte um pano preto em um tamanho apropriado e substitua a gaze úmida por este pano preto para permitir a posição de ovário livre por 30 minutos.Cole fita dupla face em um slide de microscópio. Usando fórceps, cole as manchas com ovos em uma fileira na superfície da fita de dois lados. Pressione a margem de cada patch para ter certeza de que eles grudam firmemente na fita.Colete de 50 a 100 ovos por deslizamento de microscópio. Antes da microinjeção, mantenha o microscópio deslizando no gelo para atrasar o desenvolvimento de embriões. Prepare a agulha puxando um vidro capilar usando um puxador de micro pipeta, como descrito no manuscrito do texto.Triture a ponta da agulha usando um moedor micro até uma ponta afiada. Prepare soluções de injeção adicionando dois microliters de proteína Cas9 comercializada e sgRNA à água sem RNace em um tubo PCR para obter uma mistura de volume de 10 microliteres. Misture bem por pipetting e coloque-o no gelo.Defina os parâmetros do microinjetor eletrônico. Coloque dois microliters da mistura em uma agulha usando uma ponta de pipeta de microcarregador, esgotando o máximo de ar residual na ponta da agulha possível. Conecte a agulha de injeção a um micromanípulo e garanta uma conexão apertada entre as duas partes.Coloque um slide em uma placa de Petri e coloque-o no palco do microscópio. Insira cuidadosamente a ponta da agulha no hemisfério superior de um embrião em um ângulo de 45 graus. Pressione o pedal para entregar a mistura no embrião, levando a uma leve expansão do embrião.Retire a agulha imediatamente do embrião e mova a placa de Petri com uma mão até que o próximo embrião esteja próximo da agulha. Injete pelo menos 300 embriões usando o mesmo procedimento para garantir uma quantidade suficiente de eclosão. Cubra a tampa das placas de Petri após a injeção.Quando a cor superficial dos embriões escurecer, coloque dieta artificial na placa de Petri ao redor do slide do microscópio. Prepare placas de cultura de 24 poços e encha cada poço a 1/3 de sua capacidade volumétrica com dieta artificial. Escolha a larva de eclosão usando uma pequena escova de tinta e transfira-as para a placa de cultura de 24 poços, de tal forma que um poço tenha uma larva.Quando a larva crescer para o terceiro estágio instar, transfira-as para uma nova ethrae de dúcteo de vidro. Transfira os recém-fechados adultos do sexo masculino G-zero e adultos do tipo selvagem para uma gaiola de rede fresca em uma proporção igual. Suprir-lhes com 10% de solução de açúcar descartada em bolas de algodão.Insetos traseiros usando métodos de rotina até a pupação de G-1. Use fórceps para remover cuidadosamente uma perna traseira e coloque cada perna em um tubo da Matriz de Lysing. Homogeneize a perna traseira usando um homogeneizador de tecido.Extrair o DNA genômico da amostra homogeneizada usando um kit comercial de extração de gDNA de acordo com as instruções do fabricante. Amplie o segmento genético usando primers genotipagem e as condições de reação do PCR do manuscrito do texto. Confirme o genótipo com um serviço de sequenciamento genético.Coloque indivíduos G-um do mesmo genótipo em uma gaiola de rede, autocruze as progêneres G-1 e continue a tela usando os mesmos métodos. O local alvo do gene de interesse estava localizado em seu segundo exon. Este local foi altamente conservado e o fragmento de banda alvo do sgRNA de tamanho sintetizado foi confirmado usando eletroforese de gel agarose.A detecção mutante de um único alvo sgRNA foi realizada sequenciando os produtos PCR de unidades parentais G-1. A eficácia do uso de pares de sgRNA não sobrepostos em diferentes exons foi demonstrada como a grande exclusão dos mutantes foi facilmente distinguida das panelas do tipo selvagem. Após a obtenção de um certo número de indivíduos mutantes, experimentos eletrofisiológicos ou comportamentais podem ser realizados para esclarecer a função genética e a interação entre diferentes genes.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The Successive Alleys Test of Anxiety in Mice and Rats

O Becos Teste sucessiva de ansiedade em camundongos e ratos

The plus-maze was derived from the early work of Montgomery. He observed that rats tended to avoid the open arms of a maze, preferring the enclosed ones.  ...

Comportamento

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

Holística Criação retrato falado e subsequente Line-up Vídeo Eyewitness Identificação Paradigm

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

Implantação e Gravação do Wireless Eletrorretinograma e Visual Potencial Evocado em ratos conscientes

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

Interrupção de tarefas e Paradigm Reinício para testar a Ativação e busca de um objetivo pensamento abstrato

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Métodos de emparelhamento e manutenção do par de Nova Zelândia branco coelhos (Oryctolagus Cuniculus) Via etograma comportamental, monitoramento e intervenções

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

Acompanhamento comportamental e Neuromast imagem de Cavefish mexicano

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS of Wernicke's and Broca's Areas in Studies of Language Learning and Word Acquisition

Estimulação da corrente contínua transcraniana (tDCS) das áreas de Wernicke e broca em estudos de aprendizagem de línguas e aquisição de palavras

Language is a highly important yet poorly understood function of the human brain. While studies of brain activation patterns during language comprehension ...