Name: embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31725023, 31861133019 a GW y 31171912 a CY).

1. Diseño de cebadores específicos de genes y preparación de sgRNA
<ol><li>Verificar una región genómica conservada en el gen de interés mediante análisis de amplificación y secuenciación por PCR. Amplificar el gen diana del ADN genómico de H. armigera y distinguir los exones e intrones. NOTA: La especificidad de la secuencia del sitio guía es necesaria para evitar la edición de genes fuera del objetivo. Busque posibles sitios guía en los exones que están cerca de los 5' UTR del gen. Entonces,...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. 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A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. 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T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. 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K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

La aplicación del sistema CRISPR/Cas9 ha proporcionado un potente soporte técnico para el análisis de la función génica y la interacción entre varios genes. El protocolo detallado que presentamos aquí demuestra la generación de un mutante homocigoto en H. armigera a través de la edición del genoma CRISPR/Cas9. Este procedimiento confiable proporciona una forma sencilla para la mutagénesis genética dirigida en H. armigera.
La elección de los sitios diana CRISPR po...

La aplicación de la tecnología de edición del genoma proporciona una herramienta eficiente para lograr mutantes de genes objetivo en diversas especies. La aparición del sistema agrupado de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/proteína 9 asociada (Cas9) agrupadas regularmente interespaciadas proporciona un método novedoso para manipular genomas1. El sistema CRISPR/Cas9 consiste en un ARN guía (ARNg) y la endonucleasa Cas92,3, mientras que el ARNg se puede dividir en dos partes, un ARN CRISPR complementario objetivo (ARNcr) y un ARNcr transactivante (ARNtra). El ARNg se integra con la endonucleasa Cas9 y forma una ribonucleoproteína (RNP). Con el ARNg, la endonucleasa Cas9 se puede dirigir a un sitio específico del genoma a través de la complementación de la base. Los dominios RuvC y HNH del Cas9 escinden el sitio objetivo del genoma tres bases antes de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) y crean una ruptura de doble hebra (DSB). La escisión del ADN se puede reparar a través de dos mecanismos, la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR)4. La reparación del DSB introduce inserciones o deleciones como una forma de inactivar el gen objetivo, lo que podría causar una pérdida completa de la función del gen. Por lo tanto, la heredabilidad y la especificidad del sistema CRISPR/Cas9 lo convierten en un método robusto para caracterizar las funciones genéticas in vivo y analizar las interacciones génicas5.
Con numerosos méritos, el sistema CRISPR/Cas9 se ha aplicado a diversos campos, incluyendo la biomedicina6,7, la terapia génica8,9 y la agricultura10,11,12, y se ha utilizado para diversos sistemas biológicos incluyendo microorganismos13, plantas14,15, nematodos16 y mamíferos17 . En los invertebrados, muchas especies de insectos han sido sometidas a la edición del genoma CRISPR/Cas9, como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y más allá18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera es una de las plagas más destructivas a nivel mundial23, y daña numerosos cultivos, incluyendo algodón, soja y sorgo24,25. Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación, el genoma de H. armigera, así como el de una serie de especies de insectos lepidópteros, han sido secuenciados completamente26,27,28,29. En los últimos años se han identificado y caracterizado un gran número de genes de resistencia y receptores olfativos de estos insectos19,27,28,29. Se han identificado algunos genes relacionados con la resistencia en H. armigera, como los genes que codifican para cadherina30, un transportador de casete de unión a ATP31,32, así como HaTSPAN133. La eliminación de estos genes utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 da como resultado un alto nivel de resistencia a la toxina Bacillus thuringiensis (BT) en cepas susceptibles. Además, Chang et al. (2017) eliminaron un receptor de feromonas, lo que validó su función significativa en la regulación del tiempo de apareamiento19. Estos informes sugieren que CRISPR / Cas9 puede actuar como una herramienta efectiva para estudiar la función génica in vivo en los sistemas de insectos. Sin embargo, un procedimiento detallado para la modificación de CRISPR / Cas9 en sistemas de insectos sigue siendo incompleto, lo que limita su rango de aplicación en genómica funcional de insectos.
Aquí, presentamos un protocolo para eliminar un gen funcional en H. armigera utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Se proporciona un protocolo detallado paso a paso, que incluye el diseño y la preparación de cebadores específicos de genes para la producción de ARNg, la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la identificación de mutantes. Este protocolo sirve como una referencia valiosa para manipular cualquier gen funcional en H. armigera y se puede extender a otras especies de lepidópteros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

El gusano del algodón, Helicoverpa armigera, es una de las plagas más destructivas del mundo. Una combinación de genética molecular, fisiología, genómica funcional y estudios de comportamiento ha hecho de H. armigera una especie modelo en Lepidoptera Noctuidae. Para estudiar las funciones in vivo y las interacciones entre diferentes genes, la tecnología de edición del genoma agrupadas regularmente interespaciadas de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / proteína 9 asociada (Cas9) es un método conveniente y efectivo utilizado para realizar estudios genómicos funcionales. En este estudio, proporcionamos un método sistemático paso a paso para completar la eliminación de genes en H. armigera utilizando el sistema CRISPR / Cas9. El diseño y la síntesis del ARN guía (ARNg) se describen en detalle. Luego, se resumen los pasos posteriores que consisten en el diseño de cebadores específicos de genes para la creación de ARN guía (ARNg), la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la detección de mutantes. Finalmente, se proporcionan consejos y notas para la solución de problemas para mejorar la eficiencia de la edición de genes. Nuestro método servirá como referencia para la aplicación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 en H. armigera así como en otras polillas lepidópteras.

Este protocolo proporciona pasos detallados para obtener líneas de eliminación de genes de H. armigera utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. Los resultados representativos obtenidos por este protocolo se resumen para la selección de gDNA, la recolección e inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes.
En este estudio, el sitio objetivo de nuestro gen de interés se localizó en su segund...

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Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

El gusano del algodón es una de las plagas más destructivas en todo el mundo. La edición del genoma con la tecnología CRISPR / Cas9 permite una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes en este organismo. Las dos principales ventajas de esta técnica son que tiene una alta especificidad y es hereditable.Para elegir los objetivos de sgRNA, vaya al sitio web en línea de CRISPR para buscar posibles sitios guía y los exones cercanos a la región principal no traducida del gen. Introduzca la secuencia de exones en el cuadro de texto y seleccione el genoma objetivo de Helicoverpa armigera. Elija la opción PAM para 20 BPNGG y deje las otras configuraciones en los parámetros predeterminados, de acuerdo con los manuales de usuario del sitio web.Compare las secuencias de guía predichas desde el software y elija una secuencia guía de 20 pares de bases que contengan una o dos guaninas cerca de la región no traducida de cinco primos con la mayor eficiencia predicha y el menor número de desajustes para mejorar la eficiencia de edición y reducir la edición fuera del objetivo. Para la preparación del embrión, seleccione 50 individuos sanos de machos de tres días de edad y hembras de dos días de edad, y mézclelos en una jaula de red limpia. Coloque un trozo de algodón húmedo que contenga una solución de azúcar al 10% en la jaula.Cubra las jaulas de la red con una gasa y fije la gasa con una banda elástica. Rocíe agua sobre la gasa para mantenerla húmeda. Corte un paño negro en un tamaño apropiado y reemplace la gasa húmeda con este paño negro para permitir la posición libre de óvulos durante 30 minutos.Pegue la cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de microscopio. Con fórceps, pegue los parches con huevos en una fila en la superficie de la cinta de doble cara. Presione el margen de cada parche para asegurarse de que se adhieran firmemente a la cinta.Recolecte de 50 a 100 huevos por portaobjetos de microscopio. Antes de la microinyección, mantenga el portaobjetos del microscopio sobre hielo para retrasar el desarrollo de los embriones. Prepare la aguja tirando de un vidrio capilar con un extractor de micro pipeta como se describe en el manuscrito de texto.Moler la punta de la aguja con una micro amoladora a una punta de borde afilado. Prepare soluciones de inyección agregando dos microlitros de proteína Cas9 comercializada y sgRNA al agua libre de RNace en un tubo de PCR para obtener una mezcla de volumen de 10 microlitros. Mezclar bien mediante pipeteo y ponerlo sobre hielo.Establezca los parámetros del microinyector electrónico. Cargue dos microlitros de la mezcla en una aguja usando una punta de pipeta de microcargador, agotando la mayor cantidad de aire residual posible en la punta de la aguja. Conecte la aguja de inyección a un micromanipulador y asegúrese de una conexión estrecha entre las dos partes.Coloque un portaobjetos en una placa de Petri y colóquelo en el escenario del microscopio. Inserte cuidadosamente la punta de la aguja en el hemisferio superior de un embrión en un ángulo de 45 grados. Presione el pedal para entregar la mezcla en el embrión, lo que lleva a una ligera expansión del embrión.Retraiga la aguja inmediatamente del embrión y mueva la placa de Petri con una mano hasta que el siguiente embrión esté cerca de la aguja. Inyecte al menos 300 embriones utilizando el mismo procedimiento para garantizar una cantidad suficiente de eclosión. Cubra la tapa de las placas de Petri después de la inyección.Cuando el color de la superficie de los embriones se haya oscurecido, coloque la dieta artificial en la placa de Petri alrededor del portaobjetos del microscopio. Prepare placas de cultivo de 24 pocillos y llene cada pozo a 1/3 de su capacidad volumétrica con dieta artificial. Escoja la larva de eclosión con un pincel pequeño y transfiérala a la placa de cultivo de 24 pocillos, de modo que un pozo tenga una larva.Cuando la larva crezca a la tercera etapa instar, transfiérala a una nueva técrae dúctil de vidrio. Transfiera los adultos machos G-zero recién encerrados y los adultos hembras de tipo salvaje a una jaula de red fresca en una proporción igual. Suministrarles una solución de azúcar al 10% en bolas de algodón.Criar insectos utilizando métodos de rutina hasta la pupación de G-one. Use fórceps para quitar cuidadosamente una pata trasera y coloque cada pierna en un tubo de Lysing Matrix. Homogeneizar la pata trasera utilizando un homogeneizador de tejido.Extraiga el ADN genómico de la muestra homogeneizada utilizando un kit de extracción comercial de gDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Amplificar el segmento de genes utilizando cebadores de genotipado y las condiciones de reacción de PCR del manuscrito de texto. Confirme el genotipo con un servicio de secuenciación de genes.Coloque a los individuos G-one del mismo genotipo en una jaula de red, cruce las progenies G-one y continúe cribando usando los mismos métodos. El sitio objetivo del gen de interés se localizó en su segundo exón. Este sitio fue altamente conservado y el fragmento de banda objetivo de sgRNA sintetizado se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa.La detección mutante de un solo objetivo de sgRNA se realizó mediante la secuenciación de los productos de PCR de las unidades parentales G-one. La efectividad del uso de pares de sgRNA no superpuestos en diferentes exones se demostró ya que la gran deleción de los mutantes se distinguió fácilmente de las sartenes de tipo salvaje. Después de obtener un cierto número de individuos mutantes, se pueden realizar experimentos electrofisiológicos o conductuales para aclarar la función génica y la interacción entre diferentes genes.

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Investigación

Comportamiento

Measurement of Neurophysiological Signals of Ignoring and Attending Processes in Attention Control

Medición de señales neurofisiológicas de ignorar y Asistir Procesos en Control de Atención

Attention control is the ability to selectively attend to some sensory signals while ignoring others. This ability is thought to involve two processes: ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Roedor cerebro microinyección para el Estudio de los sustratos moleculares de Comportamiento Motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Holistic Facial Composite Creation and Subsequent Video Line-up Eyewitness Identification Paradigm

Holística Creación retrato robot y posterior Alineación vídeo Eyewitness Identificación Paradigma

The paradigm detailed in this manuscript describes an applied experimental method based on real police investigations during which an eyewitness or victim ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

Implantación y grabación de Electrorretinograma Wireless y del potencial evocado visual en ratas conscientes

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

La manipulación de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) y del sueño en ratas y ratones por acupuntura

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Task Interruption and Resumption Paradigm for Testing the Activation and Pursuit of an Abstract Thinking Goal

Tarea de Interrupción y reanudación de paradigma para probar la activación y la persecución de un objetivo abstracto Pensamiento

This protocol is based on the task interruption and resumption paradigm, the premise of which is that active goals lead to persistent behavior and thus a ...

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits (Oryctolagus Cuniculus) Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Methods of Pairing and Pair Maintenance of New Zealand White Rabbits Oryctolagus Cuniculus Via Behavioral Ethogram, Monitoring, and Interventions

Métodos de emparejamiento y mantenimiento par de Nueva Zelanda blanco conejos (Cuniculus de Oryctolagus) Via etograma comportamiento, seguimiento e intervenciones

New Zealand White (NZW) laboratory rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as their ancestors the European Rabbit, are a social species that exhibit ...

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