Name: organoid-derived epithelial monolayer: a clinically relevant in vitro model for intestinal barrier function
Uploaded: 2021-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי Topsector מדעי החיים והבריאות - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ הולנד (LSH-TKI) שותפויות ציבוריות-פרטיות (PPP) של מגזר LSH ההולנדי עם מספר פרויקט LSHM16021 Organoids ככלי חדשני למידול טוקסיקולוגיה לטכנולוגיית האורגנואידים של Hubrecht (HUB) ומימון פנימי של HUB למחלקת מידול מחלות וטוקסיקולוגיה. אנו מודים למעבדות של סבין מידנדורפ (המחלקה לגסטרואנטרולוגיה של ילדים, בית החולים לילדים וילהלמינה, UMC, אוטרכט) והוגו ר' דה יונגה ומרסל J.C. Bijvelds (המחלקה לגסטרואנטרולוגיה והפטולוגיה, ארסמוס MC, רוטרדם) על מתן תמיכה טכנית ראשונית להקמת מונו-שכבות על תוספות ממברנה.

1. הכנת ריאגנטים לתרבות
הערה: בצע את כל השלבים בתוך ארון בטיחות ביולוגית ופעל לפי ההנחיות הסטנדרטיות לעבודה עם תרביות תאים. אור אולטרה סגול משמש במשך 10 דקות לפני הפעלת ארון הבטיחות הביולוגית. לפני ואחרי השימוש, פני השטח של ארון הבטיחות הביולוגית מנוקים עם נייר טישו ספוג 70% אתנ?...

<ol>
	<li>Haegebarth, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling,+lgr5,+and+stem+cells+in+the+intestine+and+skin.">Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (2020).</li><li>Mart&#237;nez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., Verhoeckx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HT29+Cell+Line.">HT29 Cell Line.</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 113-124 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5(+)+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 11 (2), 179-194 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Van De Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening.">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer.">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>d'Aldebert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+colon+organoids+from+inflammatory+bowel+disease+patients.">Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).</li><li>Dotti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+epithelial+stem+cell+compartment+could+contribute+to+permanent+changes+in+the+mucosa+of+patients+with+ulcerative+colitis.">Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis.</a> Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions.">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270 (2017).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+induces+maturation+of+Paneth+cells+in+intestinal+crypts.">Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts.</a> Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1+marks+early+secretory+progenitors+in+gut+crypts+that+can+revert+to+stem+cells+upon+tissue+damage.">Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R-spondin+protein+family.">The R-spondin protein family.</a> Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).</li><li>Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+quiescence+of+Lgr5++stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells.">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroendocrine+cells+switch+hormone+expression+along+the+crypt-to-villus+BMP+signalling+gradient.">Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).</li><li>Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5++intestinal+stem+cells+and+their+progeny.">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo.">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Blume, L. -. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability.">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).</li><li>Lea, T., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+line.">Caco-2 cell line.</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 103-111 (2015).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר את המניפולציה הכללית והתחזוקה של אורגנואידים במעיים, כמו גם את ההכנה והיישומים האפשריים של מונו-שכבות אפיתל שמקורן באורגנואידים אלה. עד כה, מונו-שכבות הוכנו בהצלחה מהתריסריון, האילאום ואזורים שונים של אורגנואידים במעי הגס שמקורם ברקמת מעיים רגילה כמו גם בעבר ובאופן פעיל ...

אפיתל המעיים פועל כמחסום פיזי בין התוכן הזוהר של המעיים לבין הרקמה הבסיסית. מחסום זה מורכב משכבת אפיתל אחת של אנטרוציטים ספיגה בעיקר המחוברים על ידי צמתים הדוקים, היוצרים קשרים בין-תאיים חזקים בין תאים סמוכים. תאים אלה יוצרים רירית אפיתל מקוטבת המפרידה בין הצדדים האפיקליים (לומן) והבזולטרליים של המעי, ובמקביל מווסתת את ההובלה הפרא-תאית של חומרים מזינים ומטבוליטים מעוכלים. בנוסף לאנטרוציטים, תאי אפיתל חשובים אחרים כגון גביע, פאנת' ותאים אנטרואנדוקריניים תורמים גם הם להומאוסטזיס של המעיים על ידי ייצור ריר, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים והורמונים, בהתאמה. אפיתל המעיים מתחדש כל הזמן על ידי חלוקת תאי גזע מצומדים לקולטן 5-חיובי (LGR5+) עשירים בלאוצין המכילים לאוצין המכילים חלבון G (LGR5+) בתחתית קריפטות המעיים המייצרים תאים מגבירי מעבר (TA) הנודדים כלפי מעלה ומתמיינים לסוגי תאים אחרים1. הפרעה להומאוסטזיס של אפיתל המעיים על ידי גורמים גנטיים וסביבתיים, כגון חשיפה לאלרגנים במזון, תרכובות רפואיות ופתוגנים מיקרוביאליים, מובילה להפרעה בתפקוד מחסום המעיים. מצבים אלה גורמים למספר מחלות מעיים, כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD), צליאק ורעילות מערכת העיכול הנגרמת על ידי תרופות2.
מחקרים על אפיתל המעיים מבוצעים באמצעות מספר מערכות פלטפורמה במבחנה כגון תוספות ממברנה, מערכות איברים על שבב, תאי Ussing וטבעות מעיים. פלטפורמות אלה מתאימות לביסוס חד-שכבתיות אפיתל מקוטבות עם גישה הן לצדדים האפיים והן לצדדים הבזולטרליים של הממברנה, תוך שימוש בקווי תאים שעברו טרנספורמציה או ברקמה ראשונית כמודלים. אף על פי שקווי תאים שעברו טרנספורמציה, כגון קווי תאי קרצינומה של המעי הגס (אדנו) Caco-2, T84 ו- HT-29, מסוגלים להתמיין לאנטרוציטים מקוטבים במעיים או לתאים המייצרים ריר במידה מסוימת, הם אינם מייצגים את האפיתל in vivo מכיוון שחסרים מספר סוגי תאים, וקולטנים ומובילים שונים מבוטאים באופן חריג3 . בנוסף, מכיוון שקווי תאים נגזרים מתורם יחיד, הם אינם מייצגים הטרוגניות בין-אשפוזית וסובלים מירידה במורכבות וברלוונטיות הפיזיולוגית. אף על פי שרקמות ראשוניות המשמשות בתאי Ussing וכטבעות מעיים מייצגות יותר את מצב ה- in vivo, הזמינות המוגבלת שלהן, הכדאיות לטווח הקצר וחוסר יכולת ההרחבה שלהן הופכים אותן לבלתי מתאימות כמדיום למחקרי תפוקה גבוהה (HT).
אורגנואידים הם תרביות אפיתל במבחנה הנוצרות מאיברים שונים כגון המעי, הכליה, הכבד, הלבלב והריאות. הם הוכחו כבעלי יכולת הרחבה ארוכת טווח ויציבה כמו גם יציבות גנטית ופנוטיפית ולכן הם מיניאטורות ביולוגיות מייצגות של האפיתל של האיבר המקורי עם תגובות נאמנות לגירויים חיצוניים 4,5,6,7,8,9. אורגנואידים מבוססים ביעילות מרקמות תקינים, חולים, מודלקים או סרטניים שנכרתו או שעברו ביופסיה, המייצגים תגובות הטרוגניות ספציפיות לחולה 10,11,12,13,14,15,16. מאמר זה מדגים כיצד לבסס מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן בתרביות אורגנואידים. מונו-שכבות הוקמו בהצלחה מתרביות אורגנואידים במעיים קטנים כמו גם מתרביות אורגנואידים במעי הגס ובפי הטבעת. מודל זה יוצר הזדמנות לחקור את ההובלה והחדירות של תאי האפיתל לתרופות, כמו גם את ההשפעות הטוקסיקולוגיות שלהם על האפיתל. יתר על כן, המודל מאפשר לתרבית משותפת עם תאי חיסון וחיידקים לחקור את האינטראקציות שלהם עם אפיתלהמעיים 17,18,19. יתר על כן, מודל זה יכול לשמש כדי לחקור תגובות לטיפולים באופן ספציפי למטופל וליזום מאמצי סינון כדי לחפש את הגל הבא של טיפולים ממוקדי מחסום אפיתל. גישה כזו יכולה להיות מורחבת למרפאה ולסלול את הדרך לטיפולים מותאמים אישית.
למרות שמונולי האפיתל בפרוטוקול זה מוכנים מאורגנואידים במעיים רגילים אנושיים, ניתן ליישם את הפרוטוקול ולהתאים אותו למודלים אורגנואידיים אחרים. מונו-שכבות אורגנואידיות אפיתל עוברות תרבית במדיום התפשטות אורגנואידי במעיים המכיל Wnt כדי לתמוך בשגשוג תאי גזע ולייצג את הרכב תאי המעיים. ניתן להעשיר את האורגנואידים במעיים כך שיהיו להם גורלות אפיתל מעיים שונים, כגון אנטרוציטים, פאנת', גביע ותאים אנטרואנדוקריניים, על ידי ויסות מסלולי Wnt, Notch וגורם גדילה אפידרמלי (EGF). כאן, לאחר הקמתם של חד-שכבתיים במדיום התפשטות, הם מונעים לעבר תאי אפיתל מעיים ממוינים יותר, כפי שתואר קודם לכן 20,21,22,23,24,25. למטרות הקרנה, בהתאם לאופן הפעולה של תרכובת העניין, תאי המטרה שלה ותנאי הניסוי, ניתן להניע את החד-שכבתיים לכיוון ההרכב התאי המועדף כדי למדוד את ההשפעות של התרכובת באמצעות קריאות פונקציונליות רלוונטיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>10644795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250, 300, and 20 &#181;L low-retention filter-tips</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>732-1432 / 732-1434 / 732-2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351156</td>
			<td rowspan="2">Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well HTS Transwell plates (Table 1)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3378</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate with Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>43-50040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black plate transparent bottom</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well fast thermal cycling plates</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well HTS Fluoroblok Transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well HTS Transwell plates (Table 1)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well transparent culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microscope (light / optical microscope)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated H2O</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>750024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>E22013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 meter with STX electrode</td>
			<td>WTI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Volac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Rspo3</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-105-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 primary antibody</td>
			<td>Sanbio</td>
			<td>BSH-7302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kova International Glasstic Slide with Counting grids</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>10298483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4358293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 8-Cap Strips</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120 086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (1000, 200, and 20 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-15334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 secondary antibody</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRKS/DPVR-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (200 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Wnt</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>N001-0.5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide ALPI1/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>GGAGTTATCCTGCTCCCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide ALPI1/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide LGR5/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>ACACGTACCCACAGAAGCTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide LGR5/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>GGAATGCAGGCCACTGAAAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide MUC2/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide MUC2/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide TBP/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>ACGCCGAATATAATCCCAAGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide TBP/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive covers</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>A25776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-2</td>
			<td>antimicrobial formulation for primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>Q32852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir for multichannel pipet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe</td>
			<td>WTI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>87023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor (Pipet-Aid)</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript 1st strand system for RT-PCR</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>11904018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Spark 10M plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>AbMole</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoid-derived epithelial monolayer: a clinically relevant in vitro model for intestinal barrier function

בעבר, מערכות מודל אפיתל מעיים היו מוגבלות לקווי תאים שעברו טרנספורמציה ולרקמות ראשוניות. למערכות מודל אלה יש מגבלות אינהרנטיות שכן הראשונות אינן מייצגות נאמנה פיזיולוגיה של רקמות מקוריות, וזמינותן של האחרונות מוגבלת. לפיכך, היישום שלהם מעכב מחקר בסיסי ופיתוח תרופות. אורגנואידים בוגרים המבוססים על תאי גזע (המכונים מעתה אורגנואידים) הם מיניאטורות של רקמת אפיתל תקינה או חולה שממנה הם נגזרים. ניתן לבסס אותם ביעילות רבה מאזורים שונים במערכת העיכול (GI), להיות בעלי יכולת הרחבה ארוכת טווח ולדמות תגובות ספציפיות לרקמות ולמטופלים לטיפולים במבחנה. כאן, הודגם כי הקמת מונו-שכבות אפיתל שמקורן באורגנואידים במעיים יחד עם שיטות למדידת שלמות מחסום אפיתל, חדירות והובלה, הפרשת חלבונים אנטי-מיקרוביאלית, כמו גם היסטולוגיה. יתר על כן, מונו-שכבות שמקורן באורגנואידים במעיים יכולות להיות מועשרות בתאי גזע מתרבים ומגבירי מעבר, כמו גם עם תאי אפיתל ממוינים מרכזיים. לכן, הם מייצגים מערכת מודל שניתן להתאים אותה כדי לחקור את ההשפעות של תרכובות על תאי המטרה ואת אופן הפעולה שלהם. למרות שתרביות אורגנואידים הן מבחינה טכנית תובעניות יותר מקווי תאים, לאחר שהן נוצרות, הן יכולות להפחית כשלים בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח תרופות מכיוון שהן באמת מייצגות מורכבות אפיתל in vivo והטרוגניות בין-אשפוזית.

איור 1A מראה תמונה מייצגת של אורגנואידים במעיים לאחר שהפשירו אותם מקריוביאל. חשוב להפשיר אורגנואידים בצפיפות גבוהה כדי להבטיח התאוששות אופטימלית. האורגנואידים מצופים בלוחות של 24 או 6 בארות בכיפות ECM של כ-10 מיקרול' (איור 1B). לרוב האורגנואידים הנורמליים במעיים...

Watch this Scientific Journal Video about Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function at JoVE.com

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

מונו-שכבות שמקורן באורגנואידים משחזרות את תפקוד מחסום אפיתל המעיים של המטופל ומאפשרות לבחון את ההשפעה של טיפולים שמטרתם לשפר את תפקוד לקוי אצל כל מטופל כדי לזהות אסטרטגיות טיפול מותאמות אישית. מונו-שכבות אורגנואידיות מספקות גישה לצד האפיקלי של האפיתל, שהוא הצד שבו מתרחש הנזק, והוא תקין ונגיש באורגנואידים הגדלים כמבנים תלת-ממדיים. כל אורגנואיד הוא שונה, ומכאן המאבק.כדי ליצור מונו-שכבות הדוקות, השתמשו באורגנואידים בשלב ההתפשטות והתעכלו במהירות כדי ליצור אשכולות של שניים עד ארבעה תאים. תגרמו את זריעת התאים לכל דגם. הדגמת ההליך תיעשה על ידי וייס ואן דורמלן, עמית מחקר בכיר ב-HUB.התחילו בציפוי תוספות ממברנה עם מטריצה חוץ-תאית או ECM. בעבודה בארון בטיחות ביולוגית, מניחים את הממברנה מכניסים לתוך לוח התמיכה. דיללו את ה-ECM 40X ב-DPBS קר כקרח עם סידן ומגנזיום, ואז פיפטה 150 מיקרוליטרים של ה-ECM המדולל לתוך התא האפיקלי של כל תוסף.הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. כדי להכין את התאים לזריעה, יש לחמם מראש ריאגנט דיסוציאציה של תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בשני מיליליטרים של המגיב עבור כל באר של צלחת שש בארות.העבירו את צלחת התרבית המכילה את האורגנואידים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית. מעבדים את האורגנואידים כמתואר בכתב היד של הטקסט, אך אינם מקבצים צינורות מרובים לצינור אחד. לאחר קצירת האורגנואידים, מוסיפים את המדיום הבסיסי או BM ל-12 מיליליטרים וצנטריפוגה ב-85 פעמים G, ואז שואפים לסופרנאטנט.מלאו את הצינור המכיל את האורגנואידים בעד 12 מיליליטרים של DPBS, ואז פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר. צנטריפוגה ב 85 פעמים G במשך חמש דקות בשמונה מעלות צלזיוס ולשאוף את supernatant מבלי להפריע לכדור האורגנואידי. מוסיפים את מגיב דיסוציאציית התאים המחומם מראש לארגנואידים ומחזרים אותם, ואז מדגרים את הצינורות באלכסון או אופקית במשך חמש דקות באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילית של חמישה מיליליטר או פיפטה P1000. בדוק את ההשעיה האורגנואידית מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם נוצרה תערובת של תאים בודדים וכמה גושי תאים המורכבים משניים עד ארבעה תאים. עצרו את דיסוציאציית התאים על ידי הוספת עד 12 מיליליטרים של BM עם מעכב ROCK לתרחיף התא.צנטריפוגה על התאים, ואז לשאוף את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור התא. כאשר מטפלים באותה תרבית אורגנואידית במספר צינורות, יש לאסוף את כדורי התאים לפני השימוש החוזר בהם ב-12 מיליליטרים של BM. מסננים את תרחיף התא דרך מסננת של 40 מיקרומטר שהורטבה מראש עם BM וקוצרים את הזרימה-דרך לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואז שוטפים את המסננת עם 10 מיליליטרים של BM וקוצרים את הזרימה-דרך לאותו צינור. מעבירים את תרחיף התאים המתוח לשני צינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר וחוזרים על הצנטריפוגה.לשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא ולהחיות את התאים בארבעה מיליליטרים של IEM בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומולר לכל צלחת תרבית מלאה המשמשת כחומר התחלה. ערבבו כמות קטנה של תרחיף תאים ביחס של אחד לאחד עם Tripan Blue לספירה, ואז ספרו את התאים וחשבו את המספר הכולל של תאים חיים, תוך ספירת כל תא בודד בגושים קטנים. הכן תרחיף תא המכיל 3X 10 עד השישי תאים חיים למיליליטר של IEM בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי.כדי לזרוע את התאים, שאפו בזהירות ל-DPBS מהתוספות מצופות ה-ECM, תוך שמירה על הצלחת אופקית. פיפט 800 מיקרוליטרים של IEM בתוספת מעכב ROCK לכל תא בזולטרלי ו-150 מיקרוליטרים של תרחיף התא שהוכנו על הממברנה המצופה ECM בתא האפיקלי. מניחים את הצלחת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.לאחר שהתאים שקעו על הממברנה, מדוד עמידות חשמלית טרנס-פיתלית או TEER מדי יום ודמיין את הממברנה מכניסה באמצעות מיקרוסקופ. כדי לרענן את המונוליירים, הסר את המדיום מהתאים הבזולטרליים של הצלחת המכילה את מכניסות הממברנה, ולאחר מכן שאף בזהירות את המדיום מהתאים האפיים. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של IEM טרי בכל תא אפיקל והוסיפו 800 מיקרוליטרים של IEM טרי לכל תא בזולטרלי.אם משתמשים במד TEER ידני, נקו את האלקטרודה עם 70% אתנול ותנו לה להתייבש באוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, ואז הניחו את האלקטרודה בצינור המכיל BM. חבר את האלקטרודה למד ה- TEER הידני וסובב את מתג הפונקציה למדידה באוהם ובמתג ההפעלה. מניחים את האלקטרודה הקצרה בתא האפי של התוסף ואת האלקטרודה הארוכה בתא הבזולטרלי מבלי לגעת במונולייר. מדוד את ההתנגדות בבאר הריקה, ולאחר מכן בדגימות הנותרות.לשטוף את האלקטרודה עם BM בין דגימות עם תנאים שונים. בסיום, נקו את האלקטרודה עם מי דמי ועם 70% אתנול, ואז תנו לה להתייבש באוויר. פרוטוקול זה שימש לקצירת אורגנואידים במעיים ולהכנת מונו-שכבות של תאי אפיתל.מונולאייר שהתרבת במשך שמונה ימים ב- IEM מוצג כאן. ניתן לראות מבנה כאשר חושפים מונו-שכבות למדיום התמיינות אנטרוציטים או EDM, בעוד שמונו-שכבות שנחשפו למדיום משולב או CDM מראות מבנה חלק יותר. היווצרות מונולאייר הייתה כמותית ואחריה מדידת TEER.למונולאייר מפגשי לחלוטין היה ערך TEER של כ-100 אוהם סנטימטר בריבוע, אשר עלה כאשר נחשף למדיום ההבחנה. מונו-שכבות בכל התנאים הבינוניים הראו חדירות נמוכה יותר לכאורה לצהוב לוציפר. הפרשת Lysozyme על ידי חד-שכבתיים איליים המתורבתים ב- IEM הייתה גבוהה יותר מזו של חד-שכבתיים המתורבתים ב- IEM עד למפגש ובמשך ארבעה ימים נוספים ב- EDM או CDM.מונו-שכבות שעברו תרבית ב-IEM, ב-IEM וב-EDM שלאחר מכן, או ב-IEM וב-CDM שלאחר מכן, מראים הבדלים במורפולוגיה שנצפתה עם הכתמים הכחולים של H&E, Ki67, MUC2 ו-Alcian Blue. עם התמיינות, התאים המתרבים פחתו, בעוד שביטוי הגנים של תאי גביע וסמן אנטרוציטים עלה בהשוואה לזה שנצפה בתנאי IEM כפי שהוכח על ידי LGR5, MUC2 וביטוי גנים של פוספטאז אלקליין. בעת הכנת monolayers, חשוב למנוע anoikis באורגנואידים לאחר העיכול אותם.בנוסף, ECM בתאים צריך להיות מופץ באופן שווה על ממברנות Transwell. מונו-שכבות שמקורן באורגנואידים מאפשרות הערכה של הובלות מולקולות באמצעות מצעים פלואורסצנטיים שונים באופן ספציפי למטופל.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

דגם העכבר של חסימת מעיים חלקית

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...