Name: organoid-derived epithelial monolayer: a clinically relevant in vitro model for intestinal barrier function
Uploaded: 2021-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function at JoVE.com

Detta arbete stöds av Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) offentlig-privata partnerskap (PPP) ersättning för den nederländska LSH-sektorn med projektnummer LSHM16021 Organoider som nytt verktyg för toxikologisk modellering till Hubrecht Organoid Technology (HUB) och HUB intern finansiering till avdelningen för sjukdomsmodellering och toxikologi. Vi tackar laboratorierna sabine Middendorp (avdelningen för pediatrisk gastroenterologi, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) och Hugo R. de Jonge och Marcel J.C. Bijvelds (Institutionen för gastroenterologi och hepatologi, Erasmus MC, Rotterdam) för att de gav initialt tekniskt stöd för att sätta upp monolager på membraninsatser.

1. Beredning av reagenser för odling
OBS: Utför alla steg inuti ett biosäkerhetsskåp och följ standardriktlinjerna för att arbeta med cellkulturer. Ultraviolett ljus används i 10 minuter innan biosäkerhetsskåpet startas. Före och efter användning rengörs ytan på biosäkerhetsskåpet med ett silkespapper dränkt i 70% etanol. För att underlätta bildandet av tredimensionella droppar extracellulär matris (ECM), håll ett förvärmt lager av 96-, 24- och 6-brunnsplattor redo i inkuba...

<ol>
	<li>Haegebarth, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling,+lgr5,+and+stem+cells+in+the+intestine+and+skin.">Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (2020).</li><li>Mart&#237;nez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., Verhoeckx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HT29+Cell+Line.">HT29 Cell Line.</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 113-124 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5(+)+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 11 (2), 179-194 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Van De Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening.">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer.">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>d'Aldebert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+colon+organoids+from+inflammatory+bowel+disease+patients.">Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).</li><li>Dotti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+epithelial+stem+cell+compartment+could+contribute+to+permanent+changes+in+the+mucosa+of+patients+with+ulcerative+colitis.">Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis.</a> Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions.">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270 (2017).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+induces+maturation+of+Paneth+cells+in+intestinal+crypts.">Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts.</a> Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1+marks+early+secretory+progenitors+in+gut+crypts+that+can+revert+to+stem+cells+upon+tissue+damage.">Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R-spondin+protein+family.">The R-spondin protein family.</a> Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).</li><li>Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+quiescence+of+Lgr5++stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells.">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroendocrine+cells+switch+hormone+expression+along+the+crypt-to-villus+BMP+signalling+gradient.">Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).</li><li>Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5++intestinal+stem+cells+and+their+progeny.">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo.">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Blume, L. -. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability.">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).</li><li>Lea, T., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+line.">Caco-2 cell line.</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 103-111 (2015).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li></ol>

Detta protokoll beskriver den allmänna manipulationen och underhållet av tarmorganoider samt beredning och möjliga tillämpningar av epitelmonolager härledda från dessa organoider. Hittills har monolager framgångsrikt framställts från tolvfingertarmen, ileum och olika regioner av kolonorganoider härledda från normal såväl som tidigare och aktivt inflammerad tarmvävnad (opublicerade data). Tillämpningen av patient-härledda organoidmonolager underlättar studien av barriärfunktionen på ett sjukdoms- och pa...

Tarmepitelet fungerar som en fysisk barriär mellan tarmarnas luminala innehåll och den underliggande vävnaden. Denna barriär består av ett enda epitelskikt av huvudsakligen absorberande enterocyter som är förbundna med snäva korsningar, vilka etablerar starka intercellulära förbindelser mellan intilliggande celler. Dessa celler bildar ett polariserat epitelfoder som separerar de apikala (lumen) och basolaterala sidorna av tarmen, samtidigt som de reglerar paracellulär transport av smälta näringsämnen och metaboliter. Förutom enterocyter bidrar andra viktiga epitelceller som bägare, Paneth och enteroendokrina celler också till intestinal homeostas genom att producera slem, antimikrobiella peptider respektive hormoner. Tarmepitelet fylls ständigt på genom att dela leucinrika upprepningsinnehållande G-proteinkopplade receptor 5-positiva (LGR5+) stamceller i botten av tarmkrypter som producerar transitförstärkande (TA) celler som migrerar uppåt och differentierar sig till andra celltyper1. Störning av intestinal epitelial homeostas av genetiska och miljömässiga faktorer, såsom exponering för matallergener, medicinska föreningar och mikrobiella patogener, leder till störningar i tarmbarriärfunktionen. Dessa tillstånd orsakar flera tarmsjukdomar inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), celiaki och läkemedelsinducerad GI-toxicitet2.
Studier på tarmepitelet utförs med hjälp av flera in vitro-plattformssystem såsom membraninsatser, organ-on-a-chip-system, Ussing-kamrar och tarmringar. Dessa plattformar är lämpliga för att etablera polariserade epitelmonolager med tillgång till både apikala och basolaterala sidor av membranet, med användning av transformerade cellinjer eller primär vävnad som modeller. Även om transformerade cellinjer, såsom kolorektala (adeno)karcinomcellinjer Caco-2, T84 och HT-29, i viss utsträckning kan differentieras till polariserade intestinala enterocyter eller slemproducerande celler, är de inte representativa för in vivo-epitelet eftersom flera celltyper saknas, och olika receptorer och transportörer uttrycks avvikande3 . Dessutom, eftersom cellinjer härrör från en enda givare, representerar de inte heterogenitet mellan patienter och lider av minskad komplexitet och fysiologisk relevans. Även om primära vävnader som används i Ussing-kamrar och som tarmringar är mer representativa för in vivo-situationen, gör deras begränsade tillgänglighet, kortsiktiga livskraft och brist på expanderbarhet dem olämpliga som ett medium för studier med hög genomströmning (HT).
Organoider är in vitro epitelkulturer etablerade från olika organ som tarm, njure, lever, bukspottkörtel och lunga. De har visat sig ha långsiktig, stabil expanderbarhet samt genetisk och fenotypisk stabilitet och är därför representativa biologiska miniatyrer av det ursprungliga organets epitel med trogna svar på yttre stimuli 4,5,6,7,8,9. Organoider etableras effektivt från antingen resekterad eller biopsierad normal, sjuk, inflammerad eller cancerös vävnad, vilket representerar heterogena patientspecifika svar 10,11,12,13,14,15,16. Detta dokument visar hur man etablerar intestinala epiteliala monolager härledda från organoidkulturer. Monolager har framgångsrikt etablerats från tunntarm samt kolon- och rektala organoidkulturer. Denna modell skapar en möjlighet att studera epitelcellernas transport och permeabilitet till läkemedel samt deras toxikologiska effekter på epitelet. Dessutom tillåter modellen samodling med immunceller och bakterier för att studera deras interaktioner med tarmepitelet 17,18,19. Dessutom kan denna modell användas för att studera svar på terapier på ett patientspecifikt sätt och initiera screeninginsatser för att leta efter nästa våg av epitelbarriärfokuserade terapier. Ett sådant tillvägagångssätt kan utvidgas till kliniken och bana väg för personliga behandlingar.
Även om epitelmonoskikten i detta protokoll framställs från humana normala tarmorganoider, kan protokollet appliceras och optimeras för andra organoidmodeller. Epitelorganoidmonolager odlas i intestinalt organoidexpansionsmedium innehållande Wnt för att stödja stamcellsproliferation och representera tarmkryptcellulär sammansättning. Tarmorganoider kan berikas för att ha olika intestinala epitelöden, såsom enterocyter, Paneth, bägare och enteroendokrina celler, genom att modulera Wnt, Notch och epidermal tillväxtfaktor (EGF) vägar. Här, efter etableringen av monolager i expansionsmedium, drivs de mot mer differentierade tarmepitelceller, som tidigare beskrivits 20,21,22,23,24,25. För screeningändamål, beroende på verkningssättet för föreningen av intresse, dess målceller och de experimentella förhållandena, kan monolaverna drivas mot den valda cellulära kompositionen för att mäta effekterna av föreningen med relevanta funktionella avläsningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>10644795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250, 300, and 20 &#181;L low-retention filter-tips</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>732-1432 / 732-1434 / 732-2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351156</td>
			<td rowspan="2">Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well HTS Transwell plates (Table 1)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3378</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate with Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>43-50040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black plate transparent bottom</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well fast thermal cycling plates</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well HTS Fluoroblok Transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well HTS Transwell plates (Table 1)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well transparent culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microscope (light / optical microscope)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated H2O</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>750024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>E22013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 meter with STX electrode</td>
			<td>WTI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Volac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Rspo3</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-105-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 primary antibody</td>
			<td>Sanbio</td>
			<td>BSH-7302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kova International Glasstic Slide with Counting grids</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>10298483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4358293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 8-Cap Strips</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120 086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (1000, 200, and 20 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-15334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 secondary antibody</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRKS/DPVR-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (200 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Wnt</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>N001-0.5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide ALPI1/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>GGAGTTATCCTGCTCCCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide ALPI1/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide LGR5/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>ACACGTACCCACAGAAGCTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide LGR5/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>GGAATGCAGGCCACTGAAAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide MUC2/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide MUC2/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide TBP/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>ACGCCGAATATAATCCCAAGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide TBP/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive covers</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>A25776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-2</td>
			<td>antimicrobial formulation for primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>Q32852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir for multichannel pipet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe</td>
			<td>WTI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>87023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor (Pipet-Aid)</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript 1st strand system for RT-PCR</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>11904018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Spark 10M plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>AbMole</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoid-derived epithelial monolayer: a clinically relevant in vitro model for intestinal barrier function

Tidigare var tarmepitelmodellsystem begränsade till transformerade cellinjer och primär vävnad. Dessa modellsystem har inneboende begränsningar eftersom de förra inte troget representerar original vävnadsfysiologi, och tillgängligheten av den senare är begränsad. Därför hindrar deras tillämpning grundläggande och läkemedelsutvecklingsforskning. Vuxna stamcellsbaserade organoider (hädanefter kallade organoider) är miniatyrer av normal eller sjuk epitelvävnad från vilken de härleds. De kan etableras mycket effektivt från olika mag-tarmkanalen (GI) regioner, har långsiktig expanderbarhet och simulerar vävnads- och patientspecifika svar på behandlingar in vitro. Här har etableringen av intestinala organoid-härledda epitelmonolager demonstrerats tillsammans med metoder för att mäta epitelbarriärintegritet, permeabilitet och transport, antimikrobiell proteinsekretion samt histologi. Dessutom kan intestinala organoid-härledda monolager berikas med prolifererande stam- och transitförstärklande celler samt med viktiga differentierade epitelceller. Därför representerar de ett modellsystem som kan skräddarsys för att studera effekterna av föreningar på målceller och deras verkningssätt. Även om organoidkulturer är tekniskt mer krävande än cellinjer, när de väl är etablerade, kan de minska misslyckanden i de senare stadierna av läkemedelsutveckling eftersom de verkligen representerar in vivo epitelkomplexitet och interpatient heterogenitet.

Figur 1A visar en representativ ljusfältsbild av tarmorganoider efter upptining av dem från en kryovial. Det är viktigt att tina organoider med hög densitet för att säkerställa optimal återhämtning. Organoider är pläterade i 24- eller 6-brunnsplattor i ECM-kupoler på cirka 10 μL (figur 1B). De flesta normala tarmorganoider har en cystisk morfologi. Efter att ha återhämtat sig från upptiningsprocessen växer organoiderna till en större storlek oc...

Watch this Scientific Journal Video about Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function at JoVE.com

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Här beskriver vi beredningen av humana organoid-härledda intestinala epitelmonolager för att studera tarmbarriärfunktion, permeabilitet och transport. Eftersom organoider representerar original epitelvävnadssvar på yttre stimuli kombinerar dessa modeller fördelarna med cellinjernas expanderbarhet och primärvävnadens relevans och komplexitet.

Organoid-härledd epitelial monolager: En kliniskt relevant in vitro-modell för tarmbarriärfunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Organoid-härledda monolager rekapitulerar patientens intestinala epitelbarriärfunktion och gör det möjligt att testa effekten av terapier som syftar till att förbättra dysfunktionen hos varje patient för att identifiera personliga behandlingsstrategier. Organoidmonolager ger tillgång till epitelets apikala sida, vilket är den sida där skadan uppstår, och den är normal och tillgänglig i organoider som växer som 3D-strukturer. Varje organoid är annorlunda, därav kampen.För att bilda täta monolager, använd organoider i proliferationsfasen och smälta snabbt för att bilda kluster av två till fyra celler. Titrera cellsådden för varje modell. Att demonstrera proceduren kommer att göras av Wies Van Dooremalen, en senior forskningsassistent vid HUB.Börja med att belägga membraninsatser med extracellulär matris eller ECM. Arbeta i ett biosäkerhetsskåp, placera membranet i stödplattan. Späd ECM 40X i iskall DPBS med kalcium och magnesium och pipettera sedan 150 mikroliter av den utspädda ECM i det apikala facket för varje insats.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i minst en timme. För att förbereda cellerna för sådd, förvärm en alikvot av celldissociationsreagens i ett 37 grader Celsius vattenbad. Använd två milliliter av reagenset för varje brunn på en sexbrunnsplatta.Överför odlingsplattan som innehåller organoiderna från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet. Bearbeta organoiderna enligt beskrivningen i textmanuskriptet, men samla inte flera rör i ett rör. Efter skörd av organoiderna, tillsätt basalmedium eller BM till 12 ml och centrifug vid 85 gånger G, aspirera sedan supernatanten.Fyll röret som innehåller organoiderna med upp till 12 ml DPBS, pipettera sedan upp och ner 10 gånger med en 10 ml pipett. Centrifugera vid 85 gånger G i fem minuter vid åtta grader Celsius och aspirera supernatanten utan att störa organoidpelleten. Tillsätt det förvärmda celldissociationsreagenset till organoiderna och resuspendera dem och inkubera sedan rören diagonalt eller horisontellt i fem minuter i vattenbadet vid 37 grader Celsius.Efter inkubationen pipettera upp och ner 10 gånger med en fem milliliter steril plastpipett eller en P1000-pipett. Kontrollera organoidsuspensionen under mikroskopet för att se om en blandning av enskilda celler och några cellklumpar bestående av två till fyra celler har bildats. Stoppa celldissociation genom att tillsätta upp till 12 ml BM med ROCK-hämmare till cellsuspensionen.Centrifugera cellerna och aspirera sedan supernatanten utan att störa cellpelleten. Vid hantering av samma organoidkultur i flera rör, slå samman cellpelletsna innan du återanvänder dem i 12 ml BM. Filtrera cellsuspensionen genom en 40 mikrometer sil förvåtad med BM och skörda genomströmningen i ett 50 ml koniskt rör, tvätta sedan silen med 10 ml BM och skörda genomströmningen i samma rör. Överför den ansträngda cellsuspensionen till två nya 15 ml koniska rör och upprepa centrifugeringen.Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och återsuspendera cellerna i fyra milliliter IEM kompletterat med 10 mikromolära ROCK-hämmare per full odlingsplatta som används som utgångsmaterial. Blanda en liten mängd cellsuspension i ett en-till-ett-förhållande med Trypan Blue för räkning, räkna sedan cellerna och beräkna det totala antalet levande celler, räkna varje enskild cell i små klumpar. Förbered en cellsuspension innehållande 3X 10 till de sjätte levande cellerna per milliliter IEM kompletterat med 10 mikromolära ROCK-hämmare.För att frö cellerna, aspirera försiktigt DPBS från de ECM-belagda insatserna och håll plattan horisontell. Pipett 800 mikroliter IEM kompletterat med ROCK-hämmare i varje basolateralt fack och 150 mikroliter av cellsuspensionen beredd på det ECM-belagda membranet i det apikala facket droppvis. Placera plattan i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.När cellerna har sedimenterat på membranet, mäta transepitelial elektrisk resistans eller TEER varje dag och avbilda membranets insatser med hjälp av ett mikroskop. För att uppdatera monolaverna, ta bort mediet från de basolaterala facken på plattan som innehåller membraninsatserna och aspirera sedan försiktigt mediet från de apikala facken. Lägg till 150 mikroliter färsk IEM droppvis i varje apikalt fack och tillsätt 800 mikroliter färsk IEM till varje basolateralt fack.Om du använder en manuell TEER-mätare, rengör elektroden med 70% etanol och låt den lufttorka inuti biosäkerhetsskåpet och placera sedan elektroden i ett rör som innehåller BM. Anslut elektroden till den manuella TEER-mätaren och vrid funktionsomkopplaren för att mäta i ohm och strömbrytaren på. Placera den korta elektroden i insatsens apikala fack och den långa elektroden i basolateralfacket utan att röra monolagret. Mät motståndet i den tomma brunnen, sedan i de återstående proverna.Tvätta elektroden med BM mellan prover med olika förhållanden. När du är klar, rengör elektroden med demivatten och med 70% etanol och låt den sedan lufttorka. Detta protokoll användes för att skörda tarmorganoider och förbereda monolager av epitelceller.Ett monolager som odlades i åtta dagar i IEM visas här. En struktur kan observeras vid exponering av monolager för enterocytdifferentieringsmedium eller EDM, medan monolager utsatta för kombinationsmedium eller CDM visar en mjukare struktur. Monolagerbildning följdes kvantitativt av mätning av TEER.Ett helt sammanflytande monolager hade ett TEER-värde på cirka 100 ohm centimeter i kvadrat vilket ökade när det utsattes för något av differentieringsmediet. Monolager under alla medelstora förhållanden visade en lägre uppenbar permeabilitet för Lucifer gul. Lysozymsekretionen av ileala monolager odlade i IEM var högre än för monolager som odlades i IEM fram till sammanflöde och i ytterligare fyra dagar i EDM eller CDM.Monolager odlade i IEM, IEM och efterföljande EDM, eller IEM och efterföljande CDM visar skillnader i morfologi som observerades med H &E, Ki67, MUC2 och Alcian Blue-färgningar. Vid differentiering minskade proliferativa celler, medan bägarecell och enterocytmarkörgenuttryck ökade jämfört med det som observerades under IEM-förhållanden som visas av LGR5, MUC2 och alkaliskt fosfatasgenuttryck. Vid beredning av monolager är det viktigt att förhindra anoikis i organoiderna efter att ha smält dem.Dessutom bör ECM i celler fördelas jämnt på Transwell-membranen. Organoid-härledda monolager möjliggör utvärdering av molekyltransporter med användning av olika fluorescerande substrat på ett patientspecifikt sätt.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Metoder för att studera Epithelial Transport proteiners funktion och uttryck i Native tarm och Caco-2-celler odlade i 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

En musmodell av partiell tarmobstruktion

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Masspektrometri analys för att identifiera Ubiquitylation av EYFP-märkt CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

En bakteriell oral utfodring assay med antibiotikabehandlade myggor

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analys av E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelregenerering som svar på joniserande bestrålning

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...