Name: discovery of metastatic regulators using a rapid and quantitative intravital chick chorioallantoic membrane model
Uploaded: 2021-02-03T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch den Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 an JDL und KS unterstützt. Dr. Lewis ist Inhaber des Frank und Carla Sojonky Lehrstuhls für Prostatakrebsforschung, der von der Alberta Cancer Foundation unterstützt wird.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Alberta durchgeführt. Vogelembryonen werden von vielen Forschungsinstituten nicht als lebende Tiere angesehen und es sind keine Tierprotokolle erforderlich. Es ist jedoch eine akzeptierte Ansicht, dass Vogelembryonen Schmerzen empfinden können und daher so human wie möglich behandelt werden müssen. Die örtliche Tierversuchsbehörde muss vor DerAufnahme von Forschungsar...

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	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Van't Veer, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer.">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li><li>Eccles, S. A., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+recent+discoveries+and+novel+treatment+strategies.">Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies.</a> Lancet. 369 (9574), 1742-1757 (2007).</li><li>Weber, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metastasis.">Molecular mechanisms of metastasis.</a> Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-driven+extracellular+matrix+remodeling+drives+haptotaxis+during+metastatic+progression.">Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).</li><li>Leong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).</li><li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research.">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151.">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).</li><li>Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cancer+metastasis+using+an+avian+embryo+model.">Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).</li><li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+whole+genome+motility+screen+reveals+novel+therapeutic+targets+to+block+cancer+metastasis.">Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis.</a> Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).</li><li>Leong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+are+required+for+cancer+cell+extravasation+and+are+a+therapeutic+target+for+metastasis.">Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis.</a> Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).</li><li>Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D., Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. , 27-37 (2016).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein auf schneller Fluoreszenzmikroskopie basierendes intravitales Screening-Protokoll, das für wichtige Anwendungen wie genetische oder Arzneimittelkandidaten-Screens verwendet werden kann. Krebszellen, die mit einer genetischen Bibliothek von Interesse transduziert oder mit einzelnen Expressionskonstrukten transfiziert wurden, können mit diesem Chick CAM-Modell schnell gescreent und auf den interessierenden Phänotyp quantifiziert werden. Da Transduktions- oder Transfektionsprotokolle je nach Bibl...

Metastasierung ist die Hauptursache für den Tod von Krebspatienten1,2,3. Metastasierte Krebszellen nutzen unterschiedliche Signalwege, abhängig von der Art des Krebses, während der fünf Schritte der metastasierten Kaskade: lokale Invasion, Intravasation, Überleben im Kreislauf, Extravasation und Kolonieexpansion an entfernten metastatischen Stellen. Das aktuelle Verständnis dieses metastasierten Prozesses legt nahe, dass es zwei Engpassschritte gibt, einer ist die gerichtete Invasion der Krebszelle aus dem Primärtumor und der zweite ist die Etablierung der metastasierten Läsion an der entfernten Stelle4,5,6. Beide Schritte erfordern, dass Krebszellen aktiv mit Kollagen und Vaskulatur an den Stellen der anfänglichen Invasion oder der Bildung von fernen metastasierten Läsionen interagieren. Daher müssen metastasierende Krebszellen in der Lage sein, sich an Zellen zu binden, Kollagenfasern umzugestalten und direkt entlang der Gefäßwände einzudringen7. Screening-Modelle, die schnell antimetostatische therapeutische Ziele identifizieren können, um Krebszellen daran zu hindern, diese Schritte abzuschließen, sind von größter Bedeutung. Bestehende In-vitro-Screening-Modelle ahmen die komplexe Lebendgewebeumgebung nicht vollständig nach. Mausmodelle sind teuer und zeitaufwendig. Daher besteht ein dringender Bedarf an intravitalen Screening-Plattformen, die komplexe Lebendgewebeumgebungen und eine schnelle Identifizierung von Zielen ermöglichen.
In den letzten zehn Jahren hat sich der Hühnerembryo als robustes und kostengünstiges Modell der menschlichen Krebsmetastasierung etabliert8,9,10,11,12. Das Chischorioallantoic Membrane (CAM) Gewebe ist dünn und durchscheinend, was es ideal für die intravitale mikroskopische Bildgebung von Zell- und Kolonieverhalten in Primärtumoren und / oder metastasierten Stellenmacht 12. Das primäre Tumorwachstum aus mehreren menschlichen Krebszelllinien kann innerhalb von nur wenigen Tagen nach der Mikroinjektion in das CAM-Gewebe initiiert und metastasiert werden. Krebszellen können auf verschiedene Arten in das CAM-Gewebe verabreicht werden, einschließlich intravenös, intra-CAM oder als Kollagen auf Pflanzen, diese Flexibilität ermöglicht es dem Forscher, sich auf bestimmte Stadien der Krebsprogression zu konzentrieren, zum Beispiel metastatische Läsionsbildung, Invasion aus dem Primärtumor oder Angiogenese.
Hier beschreiben wir eine quantitative Screening-Plattform, mit der die Fähigkeit von Krebszellen gemessen werden kann, invasive metastatische Läsionen zu etablieren. Krebszellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert wurden, werden intravenös in das CAM-Gefäßsystem mit geringer Dichte injiziert. Metastasierte Kolonien bilden sich für 4-5 Tage, dann wird die Invasionsfähigkeit und Vaskulaturinteraktion der resultierenden Kolonien bewertet. Einzelne Kolonien, die nicht eindringen, werden herausgeschnitten, vermehrt und ihr Phänotyp wird im CAM durch Reinjektion und Quantifizierung der Koloniekompaktheit und der Kontakt zwischen Krebszelle und Blutgefäßen bestätigt. Die Expressionsbibliothekskonstrukte, die für den einzelnen metastasierten Koloniemutantenphänotyp verantwortlich sind, werden aus isolierter koloniegenomischer DNA mittels Hochdurchsatzsequenzierung identifiziert. Die gleiche Plattform kann weiter verwendet werden, um den kausalen Zusammenhang zwischen einem Gen und dem beobachteten Phänotyp zu validieren oder um eingehende mechanistische Studien am beobachteten Phänotyp durchzuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge x 1 1/2&#160; BD precision needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD305196</td>
			<td>we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin solution</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 mouse breast cancer</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 mouse melanoma cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge.</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslips, 22 mm.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nikon A1r</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media appropriate for the cell lines used</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or&#160; Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendor tubes , 1.5ml</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4816-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized White Leghorn eggs</td>
			<td>any local supplyer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>must be sterilized begfore use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>MDH-4N1-50PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1080 human fibrosarcoma cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nikon Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042, FL-1041</td>
			<td>Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-468 human breast cancer</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weighting dishes&#160;</td>
			<td>Simport</td>
			<td>CA11006-614</td>
			<td>dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small surgical scissors&#160;</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes).</td>
			<td>&#160;VWR&#160;</td>
			<td>CA25378-115&#160;</td>
			<td>dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Zeiss Lumar v12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon R-3603 laboratory tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>AAC00001</td>
			<td>1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118 MG human glioblastoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG human glioblastoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller&#160;</td>
			<td>many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of metastatic regulators using a rapid and quantitative intravital chick chorioallantoic membrane model

Jüngste Fortschritte in der Krebsforschung haben die hochkomplexe Natur der Krebsmetastasierung veranschaulicht. Es wurde festgestellt, dass mehrere Gene oder Gennetzwerke an der differentiell regulierenden Krebsmetastasat von Kaskadengenen und Genprodukten beteiligt sind, die von der Krebsart, dem Gewebe und den individuellen Patientenmerkmalen abhängen. Diese stellen potenziell wichtige Ziele für genetische Therapeutika und ansätze der personalisierten Medizin dar. Die Entwicklung von Schnellscreening-Plattformen ist für die Identifizierung dieser genetischen Ziele unerlässlich.
Die Chorioallantoic Membrane (CAM) ist eine stark vaskularisierte, kollagenreiche Membran unter der Eierschale, die den Gasaustausch im sich entwickelnden Embryo ermöglicht. Aufgrund der Lage und Vaskularisierung des CAM haben wir es als intravitaselles menschliches Krebsmetastasierungsmodell entwickelt, das eine robuste Xenotransplantation menschlicher Krebszellen und echtzeitfähige Bildgebung von Krebszellinteraktionen mit der kollagenreichen Matrix und dem Gefäßsystem ermöglicht. 
Mit diesem Modell wurde eine quantitative Screening-Plattform zur Identifizierung neuartiger Treiber oder Suppressoren von Krebsmetastasen entwickelt. Wir transduzierten einen Pool von Kopf-Hals-HEp3-Krebszellen mit einer vollständigen shRNA-Genbibliothek des menschlichen Genoms und injizierten die Zellen dann mit geringer Dichte in das CAM-Gefäßsystem. Die Zellen vermehrten sich und bildeten Einzeltumorzellkolonien. Einzelne Kolonien, die nicht in das CAM-Gewebe eindringen konnten, wurden als kompakter Koloniephänotyp sichtbar und zur Identifizierung der in den Zellen vorhandenen transduzierten shRNA herausgeschnitten. Bilder einzelner Kolonien wurden auf ihre Invasivität untersucht. Mehrere Auswahlrunden wurden durchgeführt, um die Rate der Falschalarme zu senken. Einzelne, isolierte Krebszellklone oder neu entwickelte Klone, die Gene von Interesse exprimieren, wurden einem primären Tumorbildungstest oder einer Kooptionsanalyse der Krebszellengefäße unterzogen. Zusammenfassend stellen wir eine schnelle Screening-Plattform vor, die eine antimetastasierte Zielidentifikation und intravitasale Analyse einer dynamischen und komplexen Kaskade von Ereignissen ermöglicht.

Die Injektion von Krebszellen gilt als erfolgreich, wenn die Mehrheit der Zellen, die sich in den Kapillaren befinden, einzeln sind und sich in einem signifikanten Unterschied zueinander (~ 0,05-0,1 cm) befinden, so dass sich die Kolonien nach 5-6 Tagen Inkubationszeit nicht überlappen (Abbildung 3A). Die Injektion war nicht erfolgreich, wenn in den meisten Kapillaren eine Ansammlung von Krebszellen zu sehen ist, Embryonen, die dies zeigen, sollten verworfen...

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Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Dies ist eine effektive Methode, um nach Suppressoren oder Treibern von Krebsmetastasen zu suchen. Zellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert werden, werden in das Gefäßsystem der Chorioallanto-Membran des Huhns injiziert, um metastatische Kolonien zu bilden. Kolonien mit verminderter oder erhöhter Invasivität werden herausgeschnitten, erweitert, neu injektiert, um ihren Phänotyp zu bestätigen, und schließlich mit Hochdurchsatzsequenzierung analysiert.

Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

Unser Protokoll ermöglicht eine effiziente Identifizierung von Gen- oder Genkombinationen, die die Krebsinvasion im Viewer blockieren. Überkultur erfordert keine fortschrittlichen Tiereinrichtungen für die Wartung. Insgesamt können generische oder allgemeine Spezialbibliotheken innerhalb weniger Wochen im Viewer gescreent werden.Dieses Over-Screening-System wird Forschern helfen, neuartige therapeutische Genziele oder Genzielkombinationen zu entdecken, mit denen Krebsmetastasen blockiert werden können. Konzentrieren Sie die Zellen für die intravenöse Injektion auf 0,5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter, wobei Sie eiskaltes 1X PBS verwenden, um die Zellen zu verdünnen oder erneut zu suspendieren. Erwarten Sie, dass etwa ein Milliliter Zellsuspension pro 10 Embryonen benötigt wird.Um die Injektionsvorrichtung zusammenzubauen, montieren Sie eine Nadel auf die Spritze und verlängern Sie dann die Spritzennadel mit einem drei bis fünf Zentimeter langen Stück Schlauch. Brechen Sie die Spitze der Borosilikatnadel mit einer feinen Handzette. Laden Sie die Spritze mit 50 bis 200 Mikrolitern der Krebszellsuspension.Und führen Sie die Borosilikatnadel in den Schlauch ein. Untersuchen Sie die Nadel auf Zellverstopfungen und Luftblasen. Wenn eine Zellverstopfung innerhalb der Kapillare beobachtet wird, entfernen Sie die Kapillare, suspendieren Sie die Zellen erneut und ersetzen Sie sie durch eine neue Kapillare.Verwenden Sie den Kolben, um Blasen herauszudrücken. Entfernen Sie den Deckel und übertragen Sie den Embryo unter das Stereoskop. Identifizieren Sie die geeignete Vene, die auf der CAM-Oberfläche injiziert werden soll, die normalerweise nur geringfügig breiter als der Durchmesser der Borosilikatnadelspitze ist und sich in der Mitte zwischen dem Embryo und der Wiegeschalenwand befindet.Es ist im Allgemeinen einfacher, an der Stelle zu injizieren, die unmittelbar an die Venenverzweigung angrenzt. Drücken Sie die Nadelspitze gegen die Blutgefäßwand und drücken Sie sanften Druck in die gleiche Richtung wie der Blutfluss aus. Verwenden Sie bei Bedarf einen Wattestäbchen, um das injizierte Gefäß zu verankern oder zu stabilisieren.Drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig für 2 bis 10 Sekunden, bis das gewünschte Volumen injiziert ist. Entsorgen Sie den Embryo, wenn an der Injektionsstelle übermäßige Blutungen oder klare Flüssigkeitsansammlungen auftreten. Entfernen Sie die Nadel aus dem CAM und tupfen Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen ab, um Blut oder überschüssige Krebszellen zu entfernen.Decken Sie den injizierten Embryo in der Wiegeschale mit dem Deckel ab und bringen Sie ihn in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Embryonen injiziert sind. Untersuchen Sie die Embryonen visuell auf Bakterien oder Schimmelpilzkontamination oder Tod.Und entsorgen Sie kontaminierte Embryonen gemäß laborentsorgten Verfahren. Stellen Sie sicher, dass metastasierende Kolonien in den ersten ein bis drei Tagen nach der Injektion einheitlich erscheinen. Und identifizieren Sie invasive oder nichtinvasive metastatische Kolonien an den Tagen vier bis fünf nach der Injektion.Entfernen Sie am fünften Tag nach der Injektion die Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen und lokalisieren Sie die EMBRYO-CAMs auf metastatische Kolonieverteilung. Ziehen Sie unter dem Dissektionsmikroskop das CAM-Gewebe, das die metastasierende Kolonie von Interesse enthält, vorsichtig mit einer feinen Handzette nach oben und schneiden Sie es mit einer chirurgischen Schere ab. Das CAM-Gewebe in ein leeres, steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und den Röhrchendeckel schließen.Wiederholen Sie den Exzisionsprozess, bis alle interessierenden Kolonien in separaten Röhrchen gesammelt sind. Zerhacken Sie das CAM-Gewebe vorsichtig in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer separaten sterilen 18-Gauge-Nadel für jede Kolonie. Fügen Sie 100 Mikroliter 1X Kollagen-A-Lösung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.Drehen Sie die Zellen und das CAM-Gewebe bei 300 mal G für fünf Minuten bei Umgebungstemperatur herunter. Saugen Sie die Kollagen-A-Lösung an und suspendieren Sie die Zellen unvollständige Medien für die Zelllinie von Interesse. Dann drehen Sie die Zellen und das Gewebe erneut.Suspendieren Sie Zellen und Gewebestücke in einem Milliliter des vollständigen Mediums und Selektionsfaktors, falls vorhanden. Dann in eine einzige 12-Well-Gewebekulturschale gut überführen. Überwachen Sie die Krebszellen in den nächsten ein bis drei Wochen täglich auf Wachstum und Kontamination.Wenn die Zellen 70 bis 80% der Konfluenz erreichen, werden sie in eine kulturstärkere Schale überführen. Fahren Sie mit der Sequenzierung oder der nächsten Selektionsrunde fort, sobald ausreichende Krebszellenzahlen erreicht sind. Embryonen, die aufgrund einer erfolglosen Injektion eine Ansammlung von Krebszellen aufweisen, können in den meisten Kapillaren beobachtet werden.Wenn die optimale Zellkonzentration und -dauer erreicht ist, sollten die transduzierten Zellen am fünften Tag nach der Injektion eine Vielzahl von Koloniephänotypen produzieren, wobei die Mehrheit der Kolonien invasiv ist, wie durch die Krebszellen bestimmt, die im CAM-Gewebe verstreut erscheinen. Es sollte auf die metastasierten Kolonien geachtet werden, die kompakt erscheinen und weit genug von benachbarten Kolonien entfernt sind, dass sie mit Einer Zette und Schere und einem Stück CAM-Gewebe herausgeschnitten werden können. Ein isolierter positiver Bildschirmtreffer sollte bei erneuter Injektion den kompakten Koloniephänotyp anzeigen.Bei der Messung der Blutgefäßkontakte der Krebszellen sollte auf die Helligkeit der Gefäßwandflecken geachtet und die entsprechende Menge an Lektinen für das Gefäßwandsignal injiziert werden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, vermeiden Sie unter oder über Injektion und entfernen Sie übermäßige Blutungen oder Flüssigkeitsansammlungen. Mehrere neuartige Gene, die die Invasion von Krebszellen beim Betrachter vorantreiben, wurden mit dieser Technik identifiziert.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

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Forschung

Krebsforschung

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Vergleich von metastasierenden klaren Zell Nierenzellkarzinom Modell in Maus Niere und auf Huhn Chorioallantoic Membran etabliert

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

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Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

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