Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

ويود صاحبا البلاغ أن يشكرا بلانكا دوفنياك ونيكولا كوهر على مساعدتهما التقنية الممتازة.

1. تقسيم وبذر الخلايا
<ol><li>الاحماء المعقمة Dulbecco النسر المعدل المتوسط (DMEM) بما في ذلك 10٪ مصل العجل الجنيني (FCS)، الفوسفات المعقم العازلة المالحة (PBS) والريبسين العقيم إلى 37 درجة مئوية. تفعيل مقاعد البدلاء نظيفة.</li>
	<li>إعداد لوحة 6-جيدا بإضافة زلة غطاء زجاجي معقم واحد (10 ملم) إلى كل بئر باستخدام م...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

تمكن الطريقة المعروضة المحقق من تصور البروتينات الخلوية ، على سبيل المثال ، بودوسين ، نيفرين ، ومكونات الهيكل الخلوي ، على سبيل المثال ، F-actin. ضمن هذا البروتوكول، يتم استخدام خلايا cos7 المصابة كنموذج لدراسة التفاعل بين بروتينات الحجاب الحاجز الشق مع F-actin. لسوء الحظ، خطوط خلايا podocyte الخالدة ...

الزلال هو معلمة بديلة من مخاطر القلب والأوعية الدموية والنتائج من تعطيل مرشح الكبيبي1. يتكون الفلتر الكبيبي من البطانة الفينيستة، وغشاء الطابق السفلي الكبيبي والحجاب الحاجز الشقي الذي تشكله الخلايا الحبيبية. عمليات القدم الأولية والثانوية من podocytes التفاف حول جدار الشعيرات الدموية من الكبيبة2. يتم الحفاظ على الهيكل الدقيق لعمليات القدم من خلال حزم أكتين القشرية التي تعمل أيضا كمرساة لبروتينات الحجاب الحاجز متعددة الشق وغيرها من البروتينات محول2. ويسمى البروتين العمود الفقري للشق الحاجز الكليرين ويتفاعل بطريقة متجانسة مع جزيئات الكليفرين من podocytes معارضة. عن طريق البروتينات محول متنوعة, ويرتبط الكليفرين إلى الهيكل الخلوي أكتين2,3. الطفرات في الجين NPHS1 ترميز الكلية تؤدي إلى متلازمة الكلى من النوع الفنلندي4.
واحدة من البروتينات المتفاعلة في الكليفرين هو بودوسين، وهو بروتين يشبه دبوس الشعر لعائلة ستوماتين3. بودوسين يجند النيفرين إلى الطوافات الدهون ويربط ذلك إلى الهيكل الخلوي أكتين5. يتم ترميز بودوسين بواسطة الجين NPHS2. الطفرات في NPHS2 تؤدي إلى متلازمة الكلية المقاومة للستيرويد6.
لتصور والمشاركة في توطين البروتينات محول أكتين، يمكن استخدام تقنيات immunofluorescence. لسوء الحظ ، فإن حاجز الحيود للضوء يحد من دقة المجاهر الفلورية التقليدية إلى 200-350 نانومتر7. تقنيات المجهر رواية، على سبيل المثال، حفز استنفاد الانبعاثات (STED)8،الصورة تنشيط المجهر التعريب (PALM)9،مجهرية إعادة البناء البصري العشوائي (العاصفة أو dSTORM) أو المجهر حذف الحالة الأرضية تليها عودة جزيء الفردية (GSDIM)9،10،11،تمكين قرار يصل إلى ما يقرب من 10 نانومتر. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات فائقة الدقة تتطلب مجاهر باهظة الثمن ، وموظفين مدربين تدريبا جيدا ، وبالتالي فهي غير متوفرة في العديد من المختبرات.
المجهر التوسع (إكس إم) هو تقنية جديدة وبسيطة تمكن التصوير فائقة الدقة مع المجاهر التقليدية ويحتمل أن تكون متاحة لمجتمع بحثي كبير12. في المجهر توسيع الاحتفاظ بالبروتين (proExM) ، يتم إصلاح عينة من الفائدة (الخلايا أو الأنسجة) وملطخة بالفلوروفوريس13. ثم ترتكز البروتينات داخل العينة بشكل مكافئ بواسطة جزيء صغير (6-(Acryloyl)amino) حمض الهيكسانويك ، إستر succinimidyl ، AcX) في هيدروجيل قابل للانتفاخ13. من خلال الهضم الأنزيمي مع البروتين K (ProK) ، تحافظ البروتينات والفلوروفوريس على وضعها النسبي داخل الجل بعد التوسع13. بعد تورم الجل ، تتوسع العينة حتى 4.5 أضعاف (توسع حجمي 90 ضعفا) مما يؤدي إلى دقة الجانبية الفعالة من حوالي 60-70 نانومتر (300 نانومتر / 4.5). تعديلات هذه التقنية يمكن أن تسمح حتى لتوسيع 10 أضعاف (1000 أضعاف التوسع الحجمي)، مما يجعل قرار من 20-30 نانومتر على المجاهر التقليدية14،15،16.
وقد تم تصور الهياكل الكبيبية من الفئران والكلى البشرية عن طريق ExM17. ضمن هذه الورقة، نقدم بروتوكول proExM مفصل لتصور صور فائقة الدقة ل F-actin وبوبودوسين البروتين محول أكتين داخل الخلايا باستخدام المجهر الفلوري التقليدي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

تعطيل مرشح الكبيبي تتألف من بطانة الرحم الكبيبية، غشاء الطابق السفلي الكبيبي وpodocytes، والنتائج في الزلال. تحتوي عمليات القدم Podocyte على حزم أكتين ترتبط ببروتينات محول الهيكل الخلوي مثل بودوسين. تلك البروتينات محول، مثل بودوسين، ربط العمود الفقري للحجاب الحاجز شق الكبيبي، مثل الكليفرين، إلى الهيكل الخلوي أكتين. دراسة توطين ووظيفة هذه وغيرها من البروتينات podocytic أمر ضروري لفهم دور مرشح الكبيبي في الصحة والمرض. البروتوكول المقدم يمكن المستخدم من تصور أكتين، بودوسين، والنيفرين في الخلايا مع التصوير فائقة الدقة على المجهر التقليدي. أولا، الخلايا ملطخة بتقنية الفلورة المناعية التقليدية. ثم يتم تثبيت جميع البروتينات داخل العينة بشكل متناقض على هيدروجيل قابل للانتفاخ. من خلال الهضم مع البروتين K ، يتم شق البروتينات الهيكلية مما يسمح بتورم إيزوتروبي من الجل في الخطوة الأخيرة. يؤدي غسيل الكلى للعينة في الماء إلى توسيع العينة بمقدار 4-4.5 أضعاف ويمكن تصوير العينة عبر مجهر مضان تقليدي ، مما يجعل الدقة المحتملة 70 نانومتر.

يتم تصوير مفهوم وتوقيت هذا البروتوكول proExM في الشكل 1. في اليوم 5، يتم إصلاح الخلايا المصابة وملطخة بالأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف البروتين من الفائدة(الشكل 1A،B). في اليوم السادس، يؤدي العلاج ب AcX إلى تكوين مجموعات أمين على ج?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

تمكن الطريقة المقدمة من تصور البروتينات الخلوية المسماة بالفلورسنت مع المجهر التوسعي مما يؤدي إلى دقة 70 نانومتر على المجهر التقليدي.

تصوير البروتينات بودوسيتيك نيفرين، أكتين، وبودوسين مع المجهر التوسع

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

هذا البروتوكول المجهري التوسع تمكن المحقق لتصور البروتينات الكبيبية مع دقة النانو على المجهر التقليدي. الميزة الرئيسية للفحص المجهري للتوسع هي أنه متاح لمجتمع بحثي كبير. ابدأ بصنع الفواصل لغرفة الهلام.قطع رقم واحد ورقم 1.5 غطاء زجاجي ينزلق إلى خمسة خطوط ملليمتر، وذلك باستخدام سكين الماس. ضع شريحة زجاجية في حجرة تلطيخ وضع رقم 1.5 غطاء زلة المشارب على الشريحة الزجاجية، بحيث أنها تشكل مربع 2.5 سم. ماصة قطرة من الماء المقطر مزدوجة في زوايا الساحة على الانضمام إلى غطاء الزجاج زلة المشارب لبعضها البعض وإلى الشريحة الزجاجية.الانتظار لمدة 20 دقيقة تقريبا بحيث يتم إرفاق عدد 1.5 زلات الغطاء بشكل ثابت. ماصة قطرة من الماء على كل رقم 1.5 غطاء شريط زلة. ضع أربعة رقم واحد الزجاج غطاء زلة المشارب على عدد 1.5 زلات الغطاء.بالنسبة لغطاء غرفة الهلام ، قم بلف كوب غطاء مع فيلم البارافين ، وتجنب أي طيات أو أوساخ على الفيلم. لترسيخ العلاج، وإزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا الملطخة المناعية وإضافة 250 ميكرولتر من مرساة العازلة لكل بئر مباشرة على زلة الغطاء الزجاجي. احتضان لوحة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.إبقاء الركيزة في الظلام باستخدام مربع. بعد الحضانة، قم بإزالة العازلة الرسو وغسل زلة الغطاء مرة واحدة مع 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. لتلطيخ ألياف أكتين، إذابة محلول phalloidin متوافق EXM واحتضانه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.وفي الوقت نفسه، حل الأكريلات الصوديوم في الماء المقطر مزدوجة باستخدام جهاز اثارة وإعداد محلول مونومر على الجليد. إزالة phalloidin من الخلايا وغسلها مع 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، مرتين، في درجة حرارة الغرفة. ترك 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني داخل البئر بعد غسل الماضي.استخدام ملقط وقنية لرفع الغطاء زلة الزجاج من لوحة البئر الستة ووضعها في غرفة الهلام. إضافة APS إلى حل هلام ودوامة لفترة وجيزة. Pipette 200 ميكرولتر من حل هلام على العينة وإغلاق بحذر الغرفة، وتجنب فقاعات الهواء داخل هلام.إضافة الماء إلى غرفة تلطيخ، واحتضان غرفة تلطيخ لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية لبوليمرة هلام. أخرج غرفة التلطيخ من الحاضنة لفتح غطاء غرفة الهلام، أدخل شفرة حلاقة بين الغطاء والمتباعد، وأزل الغطاء بحذر.إزالة الفواصل مع شفرة الحلاقة وقطع كل هلام اضافية. استخدام فرشاة الطلاء لفصل حواف هلام. وضع الشريحة مع هلام وتغطية الزجاج في طبق مليء برنامج تلفزيوني.ثم قم بإزالة زجاج الغطاء المنفصل من الجل عن طريق هزه بلطف. ضع الشريحة أسفل الجل لإرفاق الجل بالشريحة. مع الجل على الشريحة، وتقسيم هلام إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة الحلاقة.دفع بلطف قطعة واحدة من هلام في بئر من لوحة بئر ستة مع أسفل الزجاج وتكشف مع فرشاة. استخدام فرشاة الطلاء للحفاظ على هلام مبللة مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني. باستخدام المجهر المقلوب، يمكنك التقاط صور عامة ذات فتحة رقمية منخفضة لصور ما قبل التوسع.تمييع البروتين K إلى أربع وحدات لكل ملليلتر في العازلة الهضم لجعل حل الهضم. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل بئر، وتزج هلام داخل الحل. السماح لها هضم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع غطاء مغلق للحفاظ على العينات في الظلام.إزالة محلول الهضم مع ماصة والتخلص منه. أضف ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج واحتضن الجل المغمور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الماء وإضافة ملليلتر واحد من الماء المقطر الطازجة، مزدوجة.استمر في تبادل المياه كل 10 دقائق حتى يتم الوصول إلى هضبة من التوسع ، مما تسبب في أن يصبح الجل واضحا بصريا. إزالة الماء من الجل والبدء فورا المجهر. باستخدام المجهر المقلوب، استخدم هدف الهواء عند التكبير المنخفض للعثور على خلايا في حالة ما قبل التوسع.قم بالتبديل إلى أهداف 40 X و 63 X للحصول على دقة أفضل. تثير مع الطول الموجي للاهتمام واتخاذ الصورة عبر الكاميرا. يمكن هذا البروتوكول EXM توسيع يصل إلى أربعة أضعاف.لتحديد عامل التوسع من الضروري تصوير الخلايا قبل وبعد التوسع. قد يؤدي عدم كفاية الرسو والتجانس إلى تشوهات وتمزقات في الخلايا. وترد هنا أمثلة تمثيلية لتمزق الخلايا.ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في كولوكاليس من F-أكتين والبروتينات محول أكتين, مثل بودوسين والنيفرين. يصور بودوسين باللون الأخضر، والأكاتين باللون الأزرق، والنيفرين باللون الأحمر. تشير المناطق البيضاء إلى التكون.كثافة إشارة الفلورسنت ووفرة هي المفتاح لنجاح EXM. إن الإرساء الفعال للأصباغ الفلورية عبر ACX له أهمية حاسمة لهذا البروتوكول. في أيدينا مشحم ACX هو جيد لمدة تصل إلى ثلاثة إلى أربعة أشهر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

في المختبر بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...