Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
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Les auteurs remercient Blanka Duvnjak et Nikola Kuhr pour leur excellente assistance technique.

1. Fractionnement et ensemencement des cellules
<ol><li>Réchauffez le milieu de l’aigle modifié (DMEM) stérile de Dulbecco, y compris le sérum fœtal de veau (FCS) à 10 %, la solution saline tamponnée de phosphate stérile (PBS) et la trypsine stérile à 37 °C. Activez le banc propre.</li>
	<li>Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant un glissement stérile de couvercle en verre (10 mm) à chaque puits à l’aide de forceps stériles.</li>
	<li>Mettez un plat de culture cellulaire de 10 cm avec des cellu...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

La méthode présentée permet à l’investigateur de visualiser les protéines cellulaires, p. ex., la podocine, la néphrine et les composants cytosquelettiques, p. ex., la F-actine. Dans ce protocole, les cellules cos7 transfectées sont utilisées comme modèle pour étudier l’interaction des protéines de diaphragme fendue avec la F-actine. Malheureusement, les lignées cellulaires immortalisées des podocytes n’expriment pas suffisamment de quantités endogènes de protéines diaphragmes fendues<sup class="xre...

L’albuminurie est un paramètre de substitution du risque cardiovasculaire et résulte de la perturbation du filtre glomerular1. Le filtre glomerular est composé de l’endothélium fenestrated, de la membrane glomerular de sous-sol et du diaphragme de fente formé par des podocytes. Les processus primaires et secondaires de pied des podocytes enveloppent autour de la paroi capillaire du glomerulum2. La structure délicate des processus de pied est maintenue par des faisceaux corticals d’actine qui servent également d’ancres pour les protéines multiples de diaphragme de fente et d’autres protéines d’adaptateur2. La protéine dorsale du diaphragme fendue est appelée néphrine et interagit de manière homophilique avec les molécules de néphrine des podocytes opposés. Grâce à diverses protéines adaptateurs, la néphrine est liée au cytosquelette d’actine2,3. Les mutations dans le gène d’encodage de néphrine NPHS1 mènent au syndrome néphrotique du typefinlandais 4.
L’une des protéines en interaction de la néphrine est la podocine, une protéine en épingle à cheveux de la famille des stomatines3. Podocin recrute de la néphrine aux radeaux lipidiques et la relie au cytosquelette d’actine5. La podocine est codée par le gène NPHS2. Les mutations dans NPHS2 mènent au syndrome néphrotique stéroïde-résistant6.
Pour visualiser et co-localisé les protéines adaptateurs de l’actine, des techniques d’immunofluorescence peuvent être utilisées. Malheureusement, la barrière de diffraction de la lumière limite la résolution des microscopes conventionnels de fluorescence à 200-350 nm7. De nouvelles techniques de microscopie, par exemple, l’épuisement des émissions stimulées (STED)8,la microscopie de localisation photoactivée (PALM)9,la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM ou dSTORM) ou la microscopie de suppression de l’état au sol suivie d’un retour individuel des molécules (GSDIM)9,10,11, permettent une résolution jusqu’à environ 10 nm. Cependant, ces techniques de super résolution nécessitent des microscopes très coûteux, du personnel bien formé et ne sont donc pas disponibles dans de nombreux laboratoires.
La microscopie d’expansion (ExM) est une technique nouvelle et simple qui permet l’imagerie par super résolution avec des microscopes conventionnels et qui est potentiellement disponible pour une grande communauté derecherche 12. Dans la microscopie d’expansion de rétention de protéine (proExM), l’échantillon d’intérêt (cellules ou tissu) est fixé et souillé avec des fluorophores13. Les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente par une petite molécule (6-((Acryloyl)amino)acide hexanoïque, succinimidyl ester, AcX) dans un hydrogel gonflé13. Grâce à la digestion enzymatique avec proteinase K (ProK), les protéines et les fluorophores maintiennent leur position relative dans le gel après expansion13. Après gonflement du gel, l’échantillon se dilate jusqu’à 4,5 fois (expansion volumétrique de 90 fois) menant à une résolution latérale efficace d’environ 60-70 nm (300 nm/4.5). Les modifications de cette technique peuvent même permettre une expansion 10 fois (expansion volumétrique 1000 fois), rendant une résolution de 20-30 nm sur les microscopes conventionnels14,15,16.
Des structures glomerular de souris et de reins humains ont été visualisées par l’intermédiaire d’ExM17. Dans cet article, nous présentons un protocole proExM détaillé pour visualiser des images de super résolution de F-actin et de la podocine de protéine d’actine-adaptateur dans les cellules utilisant un microscope conventionnel de fluorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

La perturbation du filtre glomerular composé de l’endothélium glomerular, de la membrane glomerular de sous-sol et des podocytes, a comme conséquence l’albuminuria. Les processus de pied de podocyte contiennent des faisceaux d’actine qui se lient aux protéines cytosquelettiques d’adaptateur telles que la podocine. Ces protéines adaptateurs, comme la podocine, relient l’épine dorsale du diaphragme fente glomérique, comme la néphrine, au cytosquelette d’actine. L’étude de la localisation et de la fonction de ces protéines podocytiques et d’autres est essentielle à la compréhension du rôle du filtre glomerular dans la santé et la maladie. Le protocole présenté permet à l’utilisateur de visualiser l’actine, la podocine et la néphrine dans les cellules avec imagerie à super résolution sur un microscope conventionnel. Premièrement, les cellules sont tachées d’une technique conventionnelle d’immunofluorescence. Toutes les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente dans un hydrogel gonflé. Grâce à la digestion avec la proteinase K, les protéines structurelles sont fendillées permettant un gonflement isotropical du gel dans la dernière étape. La dialyse de l’échantillon dans l’eau entraîne une expansion de 4 à 4,5 fois de l’échantillon et l’échantillon peut être photographié au microscope à fluorescence conventionnel, ce qui rend une résolution potentielle de 70 nm.

Le concept et le moment de ce protocole proExM sont représentés à la figure 1. Le jour 5, les cellules transfectées sont fixées et tachées d’anticorps fluorescents ciblant la protéine d’intérêt (Figure 1A,B). Le jour 6, le traitement par AcX conduit à la formation de groupes d’amine sur toutes les protéines (y compris les fluorophores) (Figure 1A,B)<...

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

La méthode présentée permet la visualisation de protéines cellulaires étiquetées fluorescentes avec microscopie d’expansion conduisant à une résolution de 70 nm sur un microscope conventionnel.

Imagerie des protéines podocytiques Nephrin, Actin et Podocin avec microscopie d’expansion

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Ce protocole microscopique d’expansion permet à l’investigateur de visualiser des protéines glomerular avec la résolution nanométrique sur un microscope conventionnel. Le principal avantage de la microscopie d’expansion est qu’elle est accessible à une vaste communauté de recherche. Commencez par faire des espaceurs pour la chambre de gelation.La couverture en verre numéro un et numéro 1,5 se glisse en cinq bandes millimétriques, à l’aide d’un couteau à diamants. Placez une glissade de verre dans une chambre de coloration et placez les bandes de glissement de couverture numéro 1,5 sur la glissière de verre, de sorte qu’elles forment un carré de 2,5 centimètres. Pipette une gouttelette d’eau distillée double dans les coins de la place pour adhérer à la couverture de verre glisser rayures les uns aux autres et à la glissade en verre.Attendez environ 20 minutes pour que les feuillets de couverture numéro 1.5 soient bien fixés. Pipette une gouttelette d’eau sur chaque numéro 1.5 bande de glissement de couverture. Placez quatre bandes de glissement de couverture en verre numéro un sur les feuillets de couverture numéro 1.5.Pour le couvercle de la chambre de gelation, envelopper un verre de couverture avec du film de paraffine, en évitant les plis ou la saleté sur le film. Pour le traitement d’ancrage, retirez le PBS des cellules vitrées immunitaires et ajoutez 250 microlitres de tampon d’ancrage par puits directement sur le glissement du couvercle en verre. Incuber la plaque pendant trois heures à température ambiante.Gardez le substrat dans l’obscurité à l’aide d’une boîte. Après l’incubation, retirer le tampon d’ancrage et laver le glissement du couvercle une fois avec 1,5 millilitres de PBS par puits. Pour tacher les fibres d’actine, décongelez une solution de phalloidine compatible EXM et incubez-la pendant 45 minutes à température ambiante.Pendant ce temps, dissoudre l’acrylate de sodium dans de l’eau distillée double à l’aide d’un dispositif d’agitation et préparer la solution monomère sur la glace. Retirer la phalloidine des cellules et les laver avec 1,5 millilitres de PBS, deux fois, à température ambiante. Laissez 1,5 millilitre de PBS dans le puits après le dernier lavage.Utilisez des forceps et une canule pour soulever le glissement de verre de couverture de la plaque de six puits et placez-le dans la chambre de gelation. Ajouter aps à la solution de gelling et vortex brièvement. Pipette 200 microlitres de solution de gelling sur l’échantillon et fermer prudemment la chambre, en évitant les bulles d’air dans le gel.Ajouter de l’eau à la chambre de coloration, et incuber la chambre de coloration pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius pour polymériser le gel. Sortez la chambre de coloration de l’incubateur. Pour ouvrir le couvercle de la chambre de gelation, introduire une lame de rasoir entre le couvercle et l’espaceur, et retirer le couvercle avec prudence.Retirez les entretaires avec la lame de rasoir et coupez tout gel supplémentaire. Utilisez un pinceau pour détacher les bords du gel. Mettre la diapositive avec le gel et couvrir le verre dans un plat rempli de PBS.Retirez ensuite le verre détaché du gel en le secouant doucement. Placez la lame sous le gel pour fixer le gel à la lame. Avec le gel sur la lame, diviser le gel en petits morceaux à l’aide de la lame de rasoir.Poussez doucement un morceau de gel dans un puits d’une plaque de six puits avec un fond de verre et dépliez-le avec un pinceau. Utilisez le pinceau pour garder le gel hydraté avec une petite quantité de PBS. À l’aide d’un microscope inversé, prenez des images d’aperçu avec une faible ouverture numérique pour les images de pré-expansion.Diluer proteinase K à quatre unités par millilitre dans le tampon de digestion pour faire la solution de digestion. Ajouter 500 microlitres de la solution de digestion à chaque puits, et plonger le gel dans la solution. Laissez-le digérer toute la nuit à température ambiante avec le couvercle fermé pour garder les échantillons dans l’obscurité.Retirer la solution de digestion à l’aide d’une pipette et la jeter. Ajouter un millilitre d’eau distillée double et incuber le gel immergé pendant 10 minutes à température ambiante. Retirer l’eau et ajouter un millilitre d’eau fraîche distillée double.Continuer à échanger de l’eau toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’un plateau d’expansion soit atteint, ce qui provoque le gel à devenir optiquement clair. Retirer l’eau du gel et commencer immédiatement la microscopie. À l’aide d’un microscope inversé, utilisez un objectif d’air à faible grossissement pour trouver des cellules dans l’état de pré-expansion.Passez aux objectifs 40 X et 63 X pour une meilleure résolution. Excitez avec la longueur d’onde de l’intérêt et de prendre l’image via la caméra. Ce protocole EXM permet une expansion jusqu’à quatre fois.Pour déterminer le facteur d’expansion, il est essentiel d’imager les cellules avant et après l’expansion. Un ancrage et une homogénéisation insuffisants peuvent entraîner des distorsions et des ruptures de cellules. Des exemples représentatifs de cellules rompues sont montrés ici.Cette méthode peut être utilisée pour étudier la colocalisation de la F-actine et des protéines adaptateurs d’actine, telles que la podocine et la néphrine. Podocin est représenté en vert, actine en bleu et néphrine en rouge. Les zones blanches indiquent la colocalisation.L’intensité et l’abondance du signal fluorescent sont essentielles au succès de l’EXM. L’ancrage efficace des colorants fluorescents via ACX est d’une importance cruciale pour ce protocole. Dans nos mains solubilized ACX est bon pour un jusqu’à trois à quatre mois.

Research

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Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

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Recherche

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Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caractériser les protéines cellulaires avec l’oxydation photochimique rapide à cellule des protéines

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules de phospholipides artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...