Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
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लेखक अपनी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ब्लैंका डुवंजक और निकोला कुहर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

1. कोशिकाओं का विभाजन और सीडिंग
<ol><li>10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और बाँझ ट्रिप्सिन सहित बाँझ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) को गर्म करें। स्वच्छ पीठ को सक्रिय करें।</li>
	<li>बाँझ सं?...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

प्रस्तुत विधि अन्वेषक को सेलुलर प्रोटीन, जैसे, पोडोसिन, नेफ्रिन और साइटोस्केलेटल घटकों, जैसे एफ-ऐक्टिन की कल्पना करने में सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल के भीतर, संक्रमित cos7 कोशिकाओं को एफ-ऐक्टिन के साथ भ...

एल्बुमिनुरिया हृदय जोखिम का एक सरोगेट पैरामीटर है और ग्लोमेरुलर फिल्टर1के व्यवधान से परिणाम है। ग्लोमरुलर फिल्टर फेनेस्ट्रेटेड एंडोथेलियम, ग्लोमरुलर बेसमेंट झिल्ली और पोडोसाइट्स द्वारा गठित स्लिट डायाफ्राम से बना है। ग्लोमरूलम2की केशिका दीवार के चारों ओर पोडोसाइट्स की प्राथमिक और माध्यमिक पैर की प्रक्रियाएं लपेटती हैं । पैरों की प्रक्रियाओं की नाजुक संरचना कॉर्टिकल ऐक्टिन बंडलों द्वारा बनाए रखी जाती है जो कई स्लिट डायाफ्राम प्रोटीन और अन्य एडाप्टर प्रोटीन के लिए लंगर के रूप में भी काम करती है2। स्लिट डायाफ्राम की बैकबोन प्रोटीन को नेफ्रिन कहा जाता है और विरोध करने वाले पोडोसाइट्स के नेफ्रिन अणुओं के साथ होमोफिलिक तरीके से बातचीत करता है। विविध एडाप्टर प्रोटीन के माध्यम से, नेफ्रिन को ऐक्टिन साइटोस्केलेटन2,3 से जोड़ाजाताहै। नेफ्रिन-एन्कोडिंग जीन NPHS1 में उत्परिवर्तन फिनिश टाइप4के नेफ्रोटिक सिंड्रोम का कारण बनता है।
नेफ्रिन के इंटरैक्टिंग प्रोटीन में से एक पॉडोसिन है, जो स्टोमेटिन परिवार का हेयरपिन जैसा प्रोटीन है3। पोडोसिन नेफ्रिन को लिपिड राफ्ट में भर्ती करता है और इसे ऐक्टिन साइटोस्केलेटन5से जोड़ता है । पोडोसिन को NPHS2 जीन द्वारा एन्कोड किया जाता है। NPHS2 में उत्परिवर्तन स्टेरॉयड प्रतिरोधी नेफ्रोटिक सिंड्रोम6के लिए सीसा ।
ऐक्टिन एडाप्टर प्रोटीन की कल्पना और सह-स्थानीयकरण करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, प्रकाश की विवर्तन बाधा पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के संकल्प को 200-350 एनएम7तक सीमित करती है। उपन्यास माइक्रोस्कोपी तकनीक, उदाहरण के लिए, उत्सर्जन की कमी (एसटीडी)8,फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम)9,स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान या डस्टॉर्म) या ग्राउंड स्टेट विलोपन माइक्रोस्कोपी के बाद व्यक्तिगत अणु वापसी (जीएसडीएम)9,10,11,लगभग 10 एनएम तक एक संकल्प सक्षम करते हैं। हालांकि, इन सुपर रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के लिए अत्यधिक महंगी माइक्रोस्कोप, अच्छी तरह से प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है और इसलिए कई प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हैं।
विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM) एक उपन्यास और सरल तकनीक है जो पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाती है और संभावित रूप से एक बड़े शोध समुदाय12के लिए उपलब्ध है। प्रोटीन प्रतिधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (प्रोएक्सएम) में, ब्याज (कोशिकाओं या ऊतक) का नमूना तय किया जाता है और फ्लोरोफोरस13के साथ दाग दिया जाता है। नमूने के भीतर प्रोटीन को एक छोटे अणु (6-(एक्रिलोइल)अमीनो) हेक्सानोइक एसिड, सुसिनिमिडिल एस्टर, एकेक्सी) द्वारा एक सूजन हाइड्रोगेल13में सहसंयोजक रूप से लंगर डाला जाता है। प्रोटीन के (प्रोके) के साथ एंजाइमेटिक पाचन के माध्यम से, प्रोटीन और फ्लोरोफोरसविस्तार 13के बाद जेल के भीतर अपनी सापेक्ष स्थिति बनाए रखते हैं। जेल की सूजन के बाद, नमूना 4.5 गुना (90-गुना वॉल्यूमेट्रिक विस्तार) तक फैलता है जिससे लगभग 60-70 एनएम (300 एनएम/4.5) का प्रभावी पार्श्व समाधान होता है। इस तकनीक के संशोधन 10 गुना विस्तार (1,000 गुना वॉल्यूमेट्रिक विस्तार) की अनुमति भी दे सकते हैं, जो पारंपरिक माइक्रोस्कोप14, 15, 16 पर 20-30एनएम का संकल्प प्रदान करसकतेहैं।
माउस और मानव गुर्दे की ग्लोमेरुलर संरचनाओं को एक्सएम17के माध्यम से कल्पना की गई है। इस पेपर के भीतर, हम एक विस्तृत प्रोएक्सएम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं के भीतर एफ-ऐक्टिन और ऐक्टिन-एडाप्टर प्रोटीन पोडोसिन की सुपर रिज़ॉल्यूशन छवियों की कल्पना करने के लिए है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

ग्लोमरुलर एंडोथेलियम, ग्लोमरुलर बेसमेंट झिल्ली और पोडोसाइट्स से बने ग्लोमेरुलर फिल्टर का व्यवधान, एल्बुमिनुरिया में परिणाम है। पोडोसाइट पैर प्रक्रियाओं में ऐक्टिन बंडल होते हैं जो साइटोस्केलेटल एडाप्टर प्रोटीन जैसे पोडोसिन से बांधते हैं। वे एडाप्टर प्रोटीन, जैसे कि पोडोसिन, ग्लोमेरुलर स्लिट डायाफ्राम की रीढ़ को लिंक करते हैं, जैसे नेफ्रिन, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन से। स्वास्थ्य और रोग में ग्लोमर्युलर फिल्टर की भूमिका की समझ के लिए इन और अन्य पोडोसाइटिक प्रोटीन के स्थानीयकरण और कार्य का अध्ययन करना आवश्यक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ कोशिकाओं में ऐक्टिन, पोडोसिन और नेफ्रिन की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। सबसे पहले, कोशिकाओं को एक पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक से सना हुआ है। नमूने के भीतर सभी प्रोटीन तो एक सूजन हाइड्रोगेल के लिए सहसंयोजक लंगर डाले जाते हैं । प्रोटीन के साथ पाचन के माध्यम से, संरचनात्मक प्रोटीन अंतिम चरण में जेल की आइसोट्रॉपिकल सूजन की अनुमति देते हैं। पानी में नमूने के डायलिसिस के परिणामस्वरूप नमूने का 4-4.5 गुना विस्तार होता है और नमूने को पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के माध्यम से इमेज किया जा सकता है, जो 70 एनएम का संभावित समाधान प्रदान करता है।

इस प्रोएक्सएम प्रोटोकॉल की अवधारणा और समय को चित्र 1में दर्शाया गया है । 5 दिन, संक्रमित कोशिकाओं को तय किया जाता है और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ ब्याज के प्रोटीन को लक्षित<strong class=...

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

प्रस्तुत विधि विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल सेलुलर प्रोटीन के दृश्य को सक्षम बनाती है जिससे पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर 70 एनएम का संकल्प होता है।

विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ पोडोसाइटिक प्रोटीन नेफ्रिन, ऐक्टिन और पोडोसिन की इमेजिंग

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

यह विस्तार सूक्ष्म प्रोटोकॉल अन्वेषक को पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर नैनोस्केल संकल्प के साथ चमकता प्रोटीन की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। विस्तार माइक्रोस्कोपी का मुख्य लाभ यह है कि यह एक बड़े अनुसंधान समुदाय के लिए सुलभ है। जेलेशन चैंबर के लिए स्पेसर बनाकर शुरू करें।कट नंबर एक और नंबर १.५ ग्लास कवर पांच मिलीमीटर धारियों में फिसल जाता है, एक हीरे चाकू का उपयोग कर । एक धुंधला कक्ष में एक ग्लास स्लाइड रखें और ग्लास स्लाइड पर संख्या 1.5 कवर स्लिप धारियों की स्थिति, ताकि वे 2.5 सेंटीमीटर वर्ग बनाएं। एक दूसरे को और ग्लास स्लाइड करने के लिए कांच कवर पर्ची धारियों का पालन करने के लिए वर्ग के कोनों में डबल आसुत पानी की एक बूंद पिपेट।लगभग 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें ताकि संख्या 1.5 कवर स्लिप को स्थिर रूप से संलग्न किया जा सके। प्रत्येक नंबर 1.5 कवर स्लिप धारी पर पानी की एक बूंद पिपेट करें। नंबर 1.5 कवर स्लिप पर चार नंबर एक ग्लास कवर स्लिप धारियों रखें।जेलेशन चैंबर ढक्कन के लिए, पैराफिन फिल्म के साथ एक कवर ग्लास लपेटें, फिल्म पर किसी भी सिलवटों या गंदगी से परहेज करें। एंकरिंग उपचार के लिए, प्रतिरक्षा दाग कोशिकाओं से पीबीएस को हटा दें और सीधे ग्लास कवर स्लिप पर बफर प्रति अच्छी तरह से प्रस्तोता के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर तीन घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट।सब्सट्रेट को बॉक्स का इस्तेमाल करते हुए अंधेरे में रखें। इनक्यूबेशन के बाद, एंकरिंग बफर को हटा दें और कवर स्लिप को एक बार पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं। ऐक्टिन फाइबर दाग करने के लिए, एक EXM संगत फल्लोइडिन समाधान गल और कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए यह इनक्यूबेट ।इस बीच, एक सरगर्मी डिवाइस का उपयोग कर डबल आसुत पानी में सोडियम एक्रिलेट भंग और बर्फ पर मोनोमर समाधान तैयार करते हैं । कोशिकाओं से फालोइडिन निकालें और उन्हें पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर के साथ धोएं, दो बार, कमरे के तापमान पर। पिछले धोने के बाद कुएं के भीतर पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर छोड़ दें।छह अच्छी तरह से प्लेट से कवर ग्लास स्लिप उठाने के लिए संदंश और एक कैनुला का उपयोग करें और इसे जेलेशन कक्ष में रखें। गेलिंग समाधान और भंवर में एपीएस संक्षेप में जोड़ें। पिपेट 200 माइक्रोलीटर नमूने पर गेलिंग समाधान के हैं और जेल के भीतर हवा के बुलबुले से बचने के लिए, कक्ष को सावधानी से बंद करते हैं।धुंधला कक्ष में पानी जोड़ें, और जेल को बहुलीकृत करने के लिए कम से कम एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला कक्ष को इनक्यूबेट करें। स्टेनिंग चैंबर को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। जेलेशन चैंबर ढक्कन खोलने के लिए, ढक्कन और स्पेसर के बीच एक रेजर ब्लेड पेश करें, और ढक्कन को सावधानी से हटा दें।रेजर ब्लेड के साथ स्पेसर्स निकालें और सभी अतिरिक्त जेल को काट दें। जेल के किनारों को अलग करने के लिए पेंट ब्रश का उपयोग करें। पीबीएस से भरी डिश में जेल और कवर ग्लास के साथ स्लाइड रखो।फिर इसे धीरे-धीरे हिलाकर जेल से अलग कवर ग्लास निकालें। स्लाइड में डालें जेल को अटैच करने के लिए जेल के नीचे की स्लाइड। स्लाइड पर जेल के साथ, रेजर ब्लेड का उपयोग करके जेल को छोटे टुकड़ों में विभाजित करें।धीरे-धीरे एक गिलास नीचे के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में जेल का एक टुकड़ा धक्का और यह एक तूलिका के साथ प्रकट करना। पीबीएस की एक छोटी राशि के साथ जेल नमी रखने के लिए तूलिका का प्रयोग करें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, पूर्व विस्तार छवियों के लिए कम संख्यात्मक एपर्चर के साथ अवलोकन छवियों को ले लो।पाचन समाधान बनाने के लिए पाचन बफर में पतला प्रोटीन के चार यूनिट प्रति मिलीलीटर। प्रत्येक अच्छी तरह से पाचन समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और समाधान के भीतर जेल विसर्जित करें। यह अंधेरे में नमूनों को रखने के लिए बंद ढक्कन के साथ कमरे के तापमान पर रात भर पचाने दें।पाचन समाधान को पिपेट से निकालकर त्याग दें। डबल आसुत पानी का एक मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डूबे हुए जेल को इनक्यूबेट करें। पानी निकालें और ताजा, डबल आसुत पानी का एक मिलीलीटर जोड़ें।विस्तार के पठार तक पहुंचने तक हर 10 मिनट में पानी का आदान-प्रदान जारी रखें, जिससे जेल ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट हो जाए। जेल से पानी निकालें और तुरंत माइक्रोस्कोपी शुरू करें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, पूर्व विस्तार राज्य में कोशिकाओं को खोजने के लिए कम आवर्धन पर एक हवा उद्देश्य का उपयोग करें ।बेहतर रिज़ॉल्यूशन के लिए 40 एक्स और 63 एक्स उद्देश्यों पर स्विच करें। ब्याज की तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजित करें और कैमरे के माध्यम से छवि लें। यह EXM प्रोटोकॉल चार गुना तक के विस्तार को सक्षम बनाता है।विस्तार कारक निर्धारित करने के लिए यह विस्तार से पहले और बाद में छवि कोशिकाओं के लिए आवश्यक है । अपर्याप्त एंकरिंग और समरूपता कोशिकाओं की विकृतियों और टूटना का कारण बन सकती है। उठी कोशिकाओं के प्रतिनिधि उदाहरण यहां दिखाए जाते हैं।इस विधि का उपयोग एफ-ऐक्टिन और ऐक्टिन एडाप्टर प्रोटीन, जैसे पोडोसिन और नेफ्रिन के कोलोकैलाइजेशन की जांच के लिए किया जा सकता है। पोडोसिन को हरे रंग में, नीले रंग में ऐक्टिन और लाल रंग में नेफ्रिन में चित्रित किया गया है। सफेद क्षेत्र कोलोकैलाइजेशन का संकेत देते हैं।फ्लोरोसेंट सिग्नल तीव्रता और बहुतायत सफल EXM के लिए महत्वपूर्ण हैं। ACX के माध्यम से फ्लोरोसेंट रंगों का कुशल प्रस्तोता इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे हाथों में घुलनशील ACX तीन से चार महीने तक के लिए अच्छा है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

इन विट्रो बहुलकीकरण के F प-actin पर जल्दी Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

संरचना और Nucleosomes की गतिशीलता परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग कर की जांच

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा extracellular Vesicles की इमेजिंग

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondria और Endoplasmic Reticulum इमेजिंग द्वारा सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण के साथ सेलुलर प्रोटीन की विशेषता

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कृत्रिम फॉस्फोलिपिड माइक्रोवेसिकल्स के साथ फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण करना

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...