Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
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Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr per l'eccellente assistenza tecnica.

1. Scissione e semina di cellule
<ol><li>Riscaldare il mezzo dell'aquila modificata (DMEM) sterile di Dulbecco, incluso il siero di vitello fetale al 10% (FCS), la salina tamponata di fosfato sterile (PBS) e la tripside sterile a 37 °C. Attivare la panca pulita.</li>
	<li>Preparare una piastra da 6 pomp po' aggiungendo un foglietto di copertura sterile in vetro (10 mm) a ciascun pozzo utilizzando forcep sterili.</li>
	<li>Metti un piatto di coltura cellulare di 10 cm con celle Cos7 sotto la panca pulita. Sotto il ban...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Il metodo presentato consente allo sperimentatore di visualizzare proteine cellulari, ad esempio podocina, nefrrina e componenti citoscheletrici, ad esempio F-actina. All'interno di questo protocollo, le cellule cos7 trasfette sono usate come modello per studiare l'interazione delle proteine del diaframma a fessura con f-actina. Sfortunatamente, le linee cellulari dei podociti immortalate non esprimono quantità endogene sufficienti di proteine del diaframma fessurato19.
<p class="jove_content...

L'albuminuria è un parametro surrogato del rischio cardiovascolare e deriva dall'interruzione del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dall'endotelio fenestrato, dalla membrana basale glomerulare e dal diaframma a fessura formato dai podociti. I processi del piede primario e secondario dei podociti avvolgono la parete capillare del glomerulum2. La delicata struttura dei processi del piede è mantenuta da fasci di actina corticale che fungono anche da ancore per proteine del diaframma a fessura multipla e altre proteine dell'adattatore2. La proteina dorsale del diaframma fessurato è chiamata nefrina e interagisce in modo omofilo con molecole di nefrrina di podociti opposti. Attraverso diverse proteine dell'adattatore, la nefrrina è legata all'actina citoscheletro2,3. Mutazioni nel gene nphrin-codificante NPHS1 portano alla sindrome nefrotica del finlandese di tipo4.
Una delle proteine interagenti della nefrina è la podocina, una proteina simile a una forcina della famiglia delle stomatine3. La podocina recluta nefrrina alle zattere lipidiche e la collega all'actina citoscheletro5. La podocina è codificata dal gene NPHS2. Mutazioni in NPHS2 portano alla sindrome nefrotica resistente agli steroidi6.
Per visualizzare e co-localizzare le proteine dell'adattatore di actina, possono essere utilizzate tecniche di immunofluorescenza. Sfortunatamente, la barriera di diffrazione della luce limita la risoluzione dei microscopi a fluorescenza convenzionali a 200-350 nm7. Le nuove tecniche di microscopia, ad esempio l'esaurimento delle emissioni stimolate (STED)8,la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)9,la microscopia per la ricostruzione ottica stocastica (STORM o dSTORM) o la microscopia a cancellazione dello stato del suolo seguita dal ritorno della singola molecola (GSDIM)9,10,11, consentono una risoluzione fino a circa 10 nm. Tuttavia, queste tecniche di super risoluzione richiedono microscopi molto costosi, personale ben addestrato e quindi non sono disponibili in molti laboratori.
La microscopia di espansione (ExM) è una tecnica nuova e semplice che consente l'imaging a super risoluzione con microscopi convenzionali ed è potenzialmente disponibile per una grande comunità di ricerca12. Nella microscopia di espansione della ritenzione proteica (proExM), il campione di interesse (cellule o tessuti) è fisso e macchiato di fluorofori13. Le proteine all'interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate da una piccola molecola (acido 6-((Acriloil)ammino)esanoico, estere succinimidile, AcX) in un idrogel gonfiabile13. Attraverso la digestione enzimatica con proteinasi K (ProK), proteine e fluorofori mantengono la loro posizione relativa all'interno del gel dopol'espansione 13. Dopo il gonfiore del gel, il campione si espande fino a 4,5 volte (espansione volumetrica di 90 volte) portando ad un'efficace risoluzione laterale di circa 60-70 nm (300 nm/4.5). Le modifiche di questa tecnica possono anche consentire un'espansione di 10 volte (espansione volumetrica di 1.000 volte), rendendo una risoluzione di 20-30 nm sui microscopiconvenzionali 14,15,16.
Le strutture glomerulari del topo e dei reni umani sono state visualizzate tramite ExM17. All'interno di questo documento, presentiamo un protocollo proExM dettagliato per visualizzare immagini a super risoluzione di F-actin e la podocina proteica dell'adattatore actina all'interno delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

L'interruzione del filtro glomerulare composto dall'endotelio glomerulare, dalla membrana basale glomerulare e dai podociti, si traduce in albuminuria. I processi del piede dei podociti contengono fasci di actina che si legano alle proteine dell'adattatore citoscheletricho come la podocina. Queste proteine dell'adattatore, come la podocina, collegano la spina dorsale del diaframma a fessura glomerulare, come la nefrina, all'actina citoscheletro. Studiare la localizzazione e la funzione di queste e di altre proteine podocitiche è essenziale per la comprensione del ruolo del filtro glomerulare nella salute e nelle malattie. Il protocollo presentato consente all'utente di visualizzare actina, podocina e nefrrina nelle cellule con imaging a super risoluzione su un microscopio convenzionale. In primo luogo, le cellule sono macchiate con una tecnica di immunofluorescenza convenzionale. Tutte le proteine all'interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate a un idrogel gonfiabile. Attraverso la digestione con proteinasi K, le proteine strutturali vengono scissa permettendo gonfiore isotropico del gel nell'ultimo passaggio. La dialisi del campione in acqua si traduce in un'espansione di 4-4,5 volte del campione e il campione può essere immaginato tramite un microscopio a fluorescenza convenzionale, rendendo una risoluzione potenziale di 70 nm.

Il concetto e la tempistica di questo protocollo proExM sono illustrati nella figura 1. Il giorno 5, le cellule trasfette sono fisse e macchiate con anticorpi fluorescenti mirati alla proteina di interesse(Figura 1A,B). Il giorno 6, il trattamento con AcX porta alla formazione di gruppi amminici su tutte le proteine (compresi i fluorofori)(Figura 1A,B)<sup class="xre...

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Il metodo presentato consente la visualizzazione di proteine cellulari etichettate fluorescentmente con microscopia di espansione che porta a una risoluzione di 70 nm su un microscopio convenzionale.

Imaging di proteine podocitiche Nefrrina, Actina e Podocina con microscopia di espansione

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Questo protocollo microscopico di espansione consente allo sperimentatore di visualizzare proteine glomerulari con risoluzione su scala nanometrica su un microscopio convenzionale. Il principale vantaggio della microscopia espansiva è che è accessibile a una grande comunità di ricerca. Inizia facendo distanziale per la camera di gelazione.Taglia il numero uno e il numero 1.5 la copertura in vetro scivola in strisce di cinque millimetri, usando un coltello diamanta. Posizionare uno scivolo di vetro in una camera di colorazione e posizionare le strisce di scorrimento del coperchio numero 1.5 sullo scivolo di vetro, in modo che formeranno un quadrato di 2,5 centimetri. Pipettare una goccia di doppia acqua distillata negli angoli del quadrato per aderire alle strisce di vetro che si infilano l'una all'altra e allo scivolo di vetro.Attendere circa 20 minuti in modo che i foglietti di copertura numero 1.5 siano attaccati stabilmente. Pipettare una goccia d'acqua su ogni numero 1.5 coprire striscia di slittamento. Posizionare quattro strisce di copertura in vetro numero uno sullo scivolo di copertura numero 1.5.Per il coperchio della camera di gelazione, avvolgere un vetro di copertura con pellicola di paraffina, evitando pieghe o sporcizia sul film. Per il trattamento di ancoraggio, rimuovere pbs dalle cellule macchiate immunitarie e aggiungere 250 microlitri di tampone di ancoraggio per pozzo direttamente sul coperchio del vetro. Incubare il piatto per tre ore a temperatura ambiente.Tenere il substrato al buio utilizzando una scatola. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di ancoraggio e lavare il coperchio scivolare una volta con 1,5 millilitri di PBS per pozzo. Per macchiare le fibre di actina, scongelare una soluzione di falloidina compatibile con EXM e incubarla per 45 minuti a temperatura ambiente.Nel frattempo, sciogliere l'acrilato di sodio in acqua distillata doppia utilizzando un dispositivo di agitazione e preparare la soluzione monomero sul ghiaccio. Rimuovere la falloidina dalle cellule e lavarle con 1,5 millilitri di PBS, due volte, a temperatura ambiente. Lasciare 1,5 millilitri di PBS all'interno del pozzo dopo l'ultimo lavaggio.Utilizzare le forcep e una cannula per sollevare lo scivolo di vetro di copertura dalla piastra dei sei pozza e posizionarlo nella camera di gelazione. Aggiungere brevemente APS alla soluzione gelificante e al vortice. Pipettare 200 microlitri di soluzione gelificante sul campione e chiudere cautamente la camera, evitando bolle d'aria all'interno del gel.Aggiungere acqua alla camera di colorazione e incubare la camera di colorazione per almeno un'ora a 37 gradi Celsius per polimerizzare il gel. Togliere la camera di colorazione dall'incubatrice. Per aprire il coperchio della camera di gelazione, introdurre una lama di rasoio tra il coperchio e il distanziale e rimuovere il coperchio con cautela.Rimuovere i distanziati con la lama del rasoio e tagliare tutto il gel extra. Utilizzare un pennello per staccare i bordi del gel. Mettere lo scivolo con il gel e coprire il vetro in un piatto pieno di PBS.Quindi rimuovere il vetro di copertura staccato dal gel scuotendolo delicatamente. Mettere la diapositiva sotto il gel per attaccare il gel alla diapositiva. Con il gel sullo scivolo, dividere il gel in piccoli pezzi usando la lama del rasoio.Spingere delicatamente un pezzo di gel in un pozzo di un piatto di sei pozzetti con un fondo di vetro e dispiegarlo con un pennello. Utilizzare il pennello per mantenere il gel idratante con una piccola quantità di PBS. Utilizzando un microscopio invertito, scatta immagini panoramiche con bassa apertura numerica per immagini pre-espansione.Diluire la proteinasi K a quattro unità per millilitro nel tampone di digestione per rendere la soluzione di digestione. Aggiungere 500 microlitri della soluzione di digestione ad ogni pozzo e immergere il gel all'interno della soluzione. Lasciare digerire durante la notte a temperatura ambiente con il coperchio chiuso per tenere i campioni al buio.Rimuovere la soluzione di digestione con una pipetta e scartarla. Aggiungere un millilitro di acqua distillata doppia e incubare il gel immerso per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'acqua e aggiungere un millilitro di acqua distillata fresca e doppia.Continuare a scambiare acqua ogni 10 minuti fino a raggiungere un altopiano di espansione, facendo sì che il gel diventi otticamente chiaro. Rimuovere l'acqua dal gel e iniziare immediatamente la microscopia. Usando un microscopio invertito, usa un obiettivo d'aria a basso ingrandimento per trovare cellule nello stato di pre-espansione.Passa agli obiettivi 40 X e 63 X per una migliore risoluzione. Eccitare con la lunghezza d'onda di interesse e prendere l'immagine tramite la fotocamera. Questo protocollo EXM consente un'espansione fino a quattro volte.Per determinare il fattore di espansione è essenziale l'immagine delle celle prima e dopo l'espansione. Un'ancoraggio e un'omogeneizzazione insufficienti possono portare a distorsioni e rotture delle cellule. Esempi rappresentativi di cellule rotture sono mostrati qui.Questo metodo può essere utilizzato per studiare la colocalizzazione delle proteine dell'adattatore F-actina e actina, come la podocina e la nefrina. La podocina è raffigurata in verde, actina in blu e nefrrina in rosso. Le aree bianche indicano la colocalizzazione.L'intensità e l'abbondanza del segnale fluorescente sono fondamentali per un EXM di successo. L'ancoraggio efficiente dei coloranti fluorescenti tramite ACX è di fondamentale importanza per questo protocollo. Nelle nostre mani l'ACX solubilizzato è buono per un massimo di tre o quattro mesi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Ricerca

Biochimica

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

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In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caratterizzare le proteine cellulari con l'ossidazione fotochimica veloce all'incell delle proteine

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...