Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy at JoVE.com

저자는 블랭카 듀브낙과 니콜라 쿠어에게 훌륭한 기술 지원을 해 준 것에 대해 감사드립니다.

1. 세포의 분할 및 파종
<ol><li>멸균 덜벡코의 변형 독수리 매체(DMEM)를 포함하여 10% 태아 종아리 혈청(FCS), 멸균 인산염 완충식식염수(PBS) 및 멸균 트립신을 37°C로 드실 수 있습니다. 깨끗한 벤치를 활성화합니다.</li>
	<li>멸균 집게를 사용하여 각 웰에 멸균 유리 커버 슬립 (10mm)을 추가하여 6 웰 플레이트를 준비하십시오.</li>
	<li>깨끗한 벤치 아래에 Cos7 세포가있는 10cm 세포 배양 접시를 넣습니다. ...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

제시된 방법은 조사자가 세포 단백질, 예를 들면, podocin, nephrin 및 cytoskeletal 분대, 예를 들면, F-actin를 구상하는 것을 가능하게 합니다. 이 프로토콜 내에서, 전감염된 cos7 세포는 F-actin와 슬릿 다이어프램 단백질의 상호 작용을 연구하는 모델로 이용됩니다. 불행하게도, 불멸의 podocyte 세포주 슬릿 다이어프램 단백질의 충분한 내인성 양을 표현하지않는다(19).
...

알부미뇨증은 심혈관 위험의 대리 매개 변수이며 사구형 필터1의중단으로 인한 결과입니다. 구체 필터는 포도세포에 의해 형성된 회향성 내피, 구체 지하 막 및 슬릿 다이어프램으로 구성됩니다. 포도세포의 기본 및 이차 발 공정은구체2의 모세관 벽을 감싸는다. 발 과정의 섬세한 구조는 또한 다중 슬릿 다이어프램 단백질 및 기타 어댑터 단백질2에대한 앵커 역할을 하는 피질 액틴 번들에 의해 유지된다. 슬릿 다이어프램의 백본 단백질은 신장이라고 불리며 반대 되는 podocytes의 네프린 분자와 동종 방식으로 상호 작용합니다. 다양한 어댑터 단백질을 통해, 네프린은 액틴 세포골격2,3에연결된다. 신장 인코딩 유전자 NPHS1의 돌연변이는 핀란드 형4의신 증후군으로 이어집니다.
네프린의 상호 작용 단백질 중 하나는 스토마틴 가족3의헤어핀 과 같은 단백질인 포도신입니다. 포도신은 지질 뗏목에 nephrin을 모집하고 액틴 세포 골격5에연결합니다. 포도신은 NPHS2 유전자에 의해 인코딩된다. NPHS2의 돌연변이는 스테로이드 저항하는 신증후군6로이끌어 낸다.
액틴 어댑터 단백질을 시각화하고 공동 국소화하기 위해 면역 형광 기술이 사용될 수 있다. 불행히도, 빛의 회절 장벽은 종래의 형광 현미경의 해상도를 200-350 nm7로제한한다. 새로운 현미경 기술, 예를 들어, 자극 방출 고갈 (STED)8,사진 활성화 국소 현미경 (PALM)9,금세 광학 재건 현미경 검사법 (STORM 또는 dSTORM) 또는 지상 상태 삭제 현미경 검사법은 개별 분자 반환 (GSDIM)9,10,11,약 10 nm까지 해상도를 가능하게한다. 그러나 이러한 슈퍼 해상도 기술은 고가의 현미경, 잘 훈련된 인력을 필요로 하므로 많은 실험실에서 사용할 수 없습니다.
확장 현미경 검사법(ExM)은 종래의 현미경으로 초분해능 이미징을 가능하게 하고 대형 연구커뮤니티(12)에서잠재적으로 사용할 수 있는 신작이고 간단한 기술이다. 단백질 보존 팽창 현미경 검사법(proExM)에서 관심 있는 샘플(세포 또는 조직)은형광구(13)로고정및 염색된다. 시료 내의 단백질은 그 때 작은 분자에 의해 공유적으로 고정됩니다 (6-((아크릴)아미노산, succinimidyl 에스테르, AcX) 팽창 하이드로겔(13)로. 단백질 효소 K(ProK)를 통한 효소 소화를 통해 단백질과 형광은 팽창 후 겔 내에서 상대적인 위치를유지한다 13. 젤의 붓기 후에, 견본은 대략 60-70 nm (300 nm/4.5)의 효과적인 측량 분해로 이끌어 내는 4.5 배 (90 배 체피 확장)까지 확장합니다. 이 기술의 수정은 10배 의 팽창(1,000배 의 체적 확장)을 허용할 수 있으며, 종래의 현미경14,15,16에대해 20-30 nm의 해상도를 렌더링할 수 있다.
마우스와 인간의 신장의 구체 구조는 ExM17을통해 시각화되었습니다. 본 논문에서, 우리는 기존의 형광 현미경을 사용하여 세포 내F 액틴및 액틴 어댑터 단백질 podocin의 슈퍼 해상도 이미지를 시각화하는 상세한 proExM 프로토콜을 제시한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

구체 내피, 구체 지하 막 및 podocytes로 구성된 구체 필터의 중단은 알부무뇨증을 초래한다. Podocyte 발 프로세스는 podocin와 같은 세포켈레탈 어댑터 단백질에 결합하는 액틴 번들을 포함합니다. 포도신과 같은 어댑터 단백질은 네프린과 같은 구슬빛 횡격막의 중추를 액틴 세포 골격에 연결합니다. 이들과 그밖 podocytic 단백질의 현지화 그리고 기능을 공부하는 것은 건강과 질병에서 구체 필터의 역할의 이해에 필수적입니다. 제시된 프로토콜은 사용자가 기존의 현미경에 슈퍼 해상도 이미징을 사용하여 세포에서 액틴, 포도신 및 nephrin을 시각화할 수 있게 합니다. 첫째, 세포는 종래의 면역 형광 기술로 염색된다. 시료 내의 모든 단백질은 팽창 가능한 하이드로겔에 공유적으로 고정됩니다. 단백질제 K를 함유한 소화를 통해 구조 단백질은 마지막 단계에서 겔의 이소열대 부종을 허용합니다. 물에서 샘플의 투석은 샘플의 4-4.5 배 팽창을 초래하고 샘플은 기존의 형광 현미경을 통해 이미지 될 수있다, 70 nm의 잠재적 인 해상도를 렌더링.

이 proExM 프로토콜의 개념과 타이밍은 그림 1에묘사됩니다. 5일째, 전감염된 세포는 관심 있는 단백질을 표적으로 하는 형광 항체로 고정되고 염색된다(도1A,B). 6일째, AcX를 가진 처리는 모든 단백질에 아민 단의 형성으로 이끌어 냅니다 (형광을 포함)(도 1A,B)12. 하...

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

제시된 방법은 확장 현미경으로 형광 표지된 세포 단백질의 시각화를 가능하게 하고 전통적인 현미경에 70 nm의 해상도로 이끌어 냅니다.

확장 현미경 검사법을 가진 Podocytic 단백질 Nephrin, 액틴 및 포도신의 화상 진찰

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

이 확장 현미경 프로토콜은 구형자가 기존의 현미경에 나노 스케일 해상도로 구체 단백질을 시각화 할 수 있게합니다. 확장 현미경 검사법의 주요 장점은 대규모 연구 커뮤니티에 액세스 할 수 있다는 것입니다. 젤레이션 챔버용 스페이서를 만드는 것으로 시작합니다.1번과 1.5번 유리 커버를 다이아몬드 나이프를 사용하여 5mm 스트라이프로 잘라냅니다. 유리 슬라이드를 염색 챔버에 넣고 유리 슬라이드에 숫자 1.5 커버 슬립 스트라이프를 배치하여 2.5 센티미터 사각형을 형성합니다. 파이프는 유리 커버 슬립 스트라이프를 서로 와 유리 슬라이드에 부착하기 위해 사각형의 모서리에 이중 증류수의 액적.숫자 1.5 커버 전표가 안정적으로 부착되도록 약 20 분 동안 기다립니다. 각 번호 1.5 커버 슬립 스트라이프에 물방울을 피펫. 4번 유리 커버 슬립 스트라이프를 숫자 1.5 커버 슬립에 놓습니다.겔화 챔버 뚜껑의 경우 덮개 유리를 파라핀 필름으로 감아 필름의 주름이나 먼지를 피하십시오. 앵커링 치료를 위해 면역 스테인드 셀에서 PBS를 제거하고 유리 커버 슬립에 직접 고정 버퍼 250 마이크로리터를 추가합니다. 상온에서 3시간 동안 접시를 배양합니다.상자를 사용하여 기판을 어둠 속에서 유지합니다. 인큐베이션 후, 앵커링 버퍼를 제거하고 1.5 밀리리터의 PBS로 한 번 커버 슬립을 잘 씻는다. 액틴 섬유를 더럽게 하려면 EXM 호환 프할로이딘 용액을 해동하고 실온에서 45분 동안 배양합니다.한편, 교반 장치를 사용하여 이중 증류수에 아크릴 나트륨을 용해하고 얼음에 단조로운 용액을 준비합니다. 세포에서 phalloidin을 제거하고 실온에서 두 번 PBS의 1.5 밀리리터로 세척하십시오. 마지막 세척 후 우물 내에 PBS1.5 밀리리터를 둡니다.집게와 캐뉼라를 사용하여 6개의 웰 플레이트에서 덮개 유리 슬립을 들어 올려 젤레이션 챔버에 넣습니다. 겔화 용액과 소용돌이에 APS를 간단히 추가합니다. 피펫 200 마이크로리터의 젤링 용액은 시료에 조심스럽게 닫아 겔 내의 기포를 피합니다.염색 실에 물을 추가하고, 젤을 중합하기 위해 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 스테인딩 챔버를 배양한다. 인큐베이터에서 염색 챔버를 꺼내십시오. 겔화 챔버 뚜껑을 열려면 뚜껑과 스페이서 사이에 면도날을 소개하고 뚜껑을 조심스럽게 제거합니다.면도날로 스페이서를 제거하고 모든 여분의 젤을 잘라냅니다. 페인트 브러시를 사용하여 젤의 가장자리를 분리합니다. 젤과 함께 슬라이드를 넣고 PBS로 채워진 접시에 유리를 덮습니다.그런 다음 젤에서 분리 된 커버 유리를 부드럽게 흔들어 제거합니다. 젤 아래에 슬라이드를 넣어 젤을 슬라이드에 부착합니다. 젤을 슬라이드에 넣고 젤을 면도날을 사용하여 작은 조각으로 나눕니다.젤 한 조각을 유리 바닥으로 6개의 웰 플레이트에 부드럽게 밀어 넣고 페인트 브러시로 펴냅니다. 소량의 PBS로 젤을 촉촉하게 유지하려면 페인트 브러시를 사용합니다. 반전된 현미경을 사용하여 확장 전 이미지에 대한 낮은 숫자 조리개와 개요 이미지를 참조하십시오.단백질을 소화 용액으로 만들기 위해 밀리리터당 4단위로 단백질을 희석합니다. 각 음소화 용액500 마이크로리터를 각 웰에 추가하고 용액 내에 젤을 담그습니다. 샘플을 어둠 속에서 유지하기 위해 뚜껑을 닫고 실온에서 밤새 소화하십시오.파이펫으로 소화 용액을 제거하고 폐기하십시오. 이중 증류수 1밀리리터를 넣고 실온에서 10분 동안 침지된 젤을 배양합니다. 물을 제거하고 신선한 이중 증류수 1 밀리리터를 추가합니다.팽창의 고원에 도달 할 때까지 10 분마다 물을 교환 계속, 젤은 광학적으로 명확해지는 원인이. 젤에서 물을 제거하고 즉시 현미경 검사를 시작합니다. 반전된 현미경을 사용하여, 확장 전 상태에서 세포를 찾기 위해 낮은 배율에서 공기 목표를 사용합니다.더 나은 해상도를 위해 40 X 및 63 X 목표로 전환합니다. 관심의 파장에 흥분하고 카메라를 통해 이미지를 가져 가라. 이 EXM 프로토콜을 사용하면 최대 4배까지 확장할 수 있습니다.확장 계수를 결정하려면 확장 전후의 이미지 셀에 필수적입니다. 부족한 앵커링과 균질화는 세포의 왜곡과 파열로 이어질 수 있습니다. 파열된 세포의 대표적인 예가 여기에 나와 있다.이 방법은 포도신 및 네프린과 같은 F-액틴 및 액틴 어댑터 단백질의 공동 국화를 조사하는 데 사용될 수 있다. 포도신은 녹색으로 묘사되고, 파란색으로 액틴을, 네프린은 빨간색으로 묘사됩니다. 흰색 영역은 공동 지역화를 나타냅니다.형광 신호 강도와 풍부함은 성공적인 EXM의 핵심입니다. ACX를 통한 형광염료의 효율적인 고정은 이 프로토콜에 매우 중요합니다. 우리의 손에 용해 ACX는 최대 3 ~ 4 개월 동안 좋다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

세포 내 빠른 광화학적 단백질 산화로 세포 단백질 특성화

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...