Name: imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00
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Os autores gostariam de agradecer a Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr por sua excelente assistência técnica.

1. Divisão e semeadura de células
<ol><li>Aqueça o Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco, incluindo soro de bezerro fetal de 10%, soro tamponado fosfato estéril (PBS) e trippsina estéril a 37 °C. Ative o banco limpo.</li>
	<li>Prepare uma placa de 6 poços adicionando um deslizamento de tampa de vidro estéril (10 mm) a cada poço usando fórceps estéreis.</li>
	<li>Coloque um prato de cultura celular de 10 cm com células Cos7 sob o banco limpo. Sob o banco limpo, aspire o meio das células usando um di...

<ol>
	<li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+up:+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton.">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+of+nephrin,+podocin,+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation.">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling.">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).</li><li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHS2,+encoding+the+glomerular+protein+podocin,+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome.">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength.">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy.">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation.">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues.">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy.">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

O método apresentado permite ao pesquisador visualizar proteínas celulares, por exemplo, podocina, nefrina e componentes citoesqueletal, por exemplo, F-actin. Dentro deste protocolo, as células cos7 transfectadas são usadas como modelo para estudar a interação de proteínas de diafragma cortadas com F-actin. Infelizmente, as linhas celulares podocyte imortalizadas não expressam quantidades endógenas suficientes de proteínas de diafragma cortadas19.
Com este mé...

Albuminúria é um parâmetro substituto de risco cardiovascular e resulta da interrupção do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto do endotélio fenestrado, da membrana glomerular do porão e do diafragma cortado formado por podocitos. Processos primários e secundários de pés de podocitos envolvem a parede capilar do glomerulum2. A estrutura delicada dos processos dos pés é mantida por feixes de actina cortical que também servem como âncoras para proteínas de diafragma de fenda múltipla e outras proteínasadaptadoras 2. A proteína backbone do diafragma é chamada de nefrina e interage de forma homofílica com moléculas de nefetos de podocitos opostos. Através de diversas proteínas adaptadoras, a nefrina está ligada ao citoesqueleto de actina2,3. Mutações no gene de codificação de nefrina NPHS1 levam à síndrome nefrótica do finlandês tipo4.
Uma das proteínas interativas de nefrina é a podocina, uma proteína semelhante ao grampo de cabelo da família estomatina3. Podocin recruta nefrina para jangadas lipídicas e a liga ao citoesqueleto de actina5. Podocina é codificado pelo gene NPHS2. Mutações no NPHS2 levam à síndrome nefrótica resistente a esteroides6.
Para visualizar e co-localizar proteínas adaptadoras de actina, podem ser utilizadas técnicas de imunofluorescência. Infelizmente, a barreira de difração da luz limita a resolução de microscópios convencionais de fluorescência para 200-350 nm7. Novas técnicas de microscopia, por exemplo, estimuladas pelo esgotamento das emissões (STED)8,microscopia de localização ativada por foto (PALM)9,microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM ou dSTORM) ou microscopia de exclusão de estado terrestre seguida pelo retorno individual da molécula (GSDIM)9,10,11, permitem uma resolução de aproximadamente 10 nm. No entanto, essas técnicas de super resolução exigem microscópios altamente caros, pessoal bem treinado e, portanto, não estão disponíveis em muitos laboratórios.
A microscopia de expansão (ExM) é uma técnica nova e simples que permite imagens de super resolução com microscópios convencionais e está potencialmente disponível para uma grande comunidade de pesquisa12. Na microscopia de expansão de retenção de proteínas (proExM), a amostra de interesse (células ou tecidos) é fixa e manchada com fluoroforos13. As proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas por uma pequena molécula (6-(Acryloyl)amino)ácido hexanoico, éster succinimidyl, AcX) em um hidrogel inchado13. Através da digestão enzimática com proteinase K (ProK), proteínas e fluoroforos mantêm sua posição relativa dentro do gel após a expansão13. Após o inchaço do gel, a amostra expande-se até 4,5 vezes (expansão volutiva de 90 vezes) levando a uma resolução lateral eficaz de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4.5). Modificações desta técnica podem até permitir uma expansão de 10 vezes (expansão volutiva de 1.000 vezes), tornando uma resolução de 20-30 nm nos microscópios convencionais14,15,16.
Estruturas glomerulares de camundongos e rins humanos foram visualizadas via ExM17. Dentro deste artigo, apresentamos um protocolo proExM detalhado para visualizar imagens de super resolução de F-actin e podocina de proteína actina dentro das células usando um microscópio de fluorescência convencional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide &#62;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-20770</td>
			<td>store up to 4 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12432</td>
			<td>24x32mm #1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamont cutter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-0392</td>
			<td>for cutting the cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td>8M Stock can be kept at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marten hair paintbrush</td>
			<td>Leon Hardy</td>
			<td>3 (770)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Menzel&#34; Deckgl&#228;ser (cover glasses)</td>
			<td>Thermo Fischer&#160;</td>
			<td>15654786</td>
			<td>24x24mm #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objekttr&#228;ger UniMark</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>703010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td>check purity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced at the university&#39;s workshop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin-ExM 546&#160;</td>
			<td>chrometra</td>
			<td>non-available</td>
			<td>1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Podocin produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0372-200UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti guinea-pig CF633</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB4600129-50UL</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti rabbit 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti nephrin</td>
			<td>Origene</td>
			<td>BP5030</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXIO Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>non-available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of podocytic proteins nephrin, actin, and podocin with expansion microscopy

A interrupção do filtro glomerular composto pelo endotélio glomerular, membrana glomerular do porão e podocitos, resulta em albuminúria. Os processos do pé podocyte contêm feixes de actina que se ligam a proteínas adaptadoras citoesquelletal, como a podocina. Essas proteínas adaptadoras, como a podocina, ligam a espinha dorsal do diafragma de fenda glomerular, como a nefrina, ao citoesqueleto de actina. Estudar a localização e função dessas e outras proteínas podocíticas é essencial para a compreensão do papel do filtro glomerular na saúde e na doença. O protocolo apresentado permite que o usuário visualize actina, podocina e nefrina em células com imagens de super resolução em um microscópio convencional. Primeiro, as células são manchadas com uma técnica convencional de imunofluorescência. Todas as proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas a um hidrogel inchado. Através da digestão com proteinase K, as proteínas estruturais são cortadas permitindo o inchaço isotropical do gel na última etapa. A diálise da amostra na água resulta em uma expansão de 4-4,5 vezes da amostra e a amostra pode ser imageda através de um microscópio de fluorescência convencional, tornando uma resolução potencial de 70 nm.

O conceito e o tempo deste protocolo proExM são retratados na Figura 1. No dia 5, as células transfeinadas são fixas e manchadas com anticorpos fluorescentes voltados para a proteína de interesse (Figura 1A,B). No dia 6, o tratamento com AcX leva à formação de grupos de amina em todas as proteínas (incluindo fluoroforos) (Figura 1A,B)12</sup...

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

O método apresentado permite a visualização de proteínas celulares fluorescentes com microscopia de expansão levando a uma resolução de 70 nm em um microscópio convencional.

Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Este protocolo microscópico de expansão permite ao pesquisador visualizar proteínas glomerulares com resolução de nanoescala em um microscópio convencional. A principal vantagem da microscopia de expansão é que ela é acessível a uma grande comunidade de pesquisa. Comece fazendo espaçadores para a câmara de gelação.Corte número um e número 1,5 tampa de vidro desliza em listras de cinco milímetros, usando uma faca de diamante. Coloque um deslizamento de vidro em uma câmara de coloração e posicione as listras de deslizamento de cobertura número 1,5 no escorregador de vidro, de modo que eles formem um quadrado de 2,5 centímetros. Pipeta uma gota de água dupla destilada nos cantos da praça para aderir as listras de deslizamento de tampa de vidro uns aos outros e ao deslizamento de vidro.Aguarde aproximadamente 20 minutos para que os deslizamentos de cobertura número 1.5 sejam fixados. Pipeta uma gota de água em cada listra de deslizamento de cobertura número 1.5. Coloque quatro listras de deslizamento de tampa de vidro número um nos deslizamentos de cobertura número 1.5.Para a tampa da câmara de gelação, enrole um copo de cobertura com filme de parafina, evitando quaisquer dobras ou sujeira no filme. Para o tratamento de ancoragem, remova o PBS das células imunotravas e adicione 250 microliters de tampão de ancoragem por poço diretamente no deslizamento da tampa do vidro. Incubar a placa por três horas em temperatura ambiente.Mantenha o substrato no escuro usando uma caixa. Após a incubação, remova o tampão de ancoragem e lave o deslizamento da tampa uma vez com 1,5 mililitros de PBS por poço. Para coloricionar as fibras de actina, descongele uma solução de faloidóide compatível com EXM e incuba-a por 45 minutos à temperatura ambiente.Enquanto isso, dissolva o acrilato de sódio em água dupla destilada usando um dispositivo de agitação e prepare a solução de monômero no gelo. Remova a falooidina das células e lave-as com 1,5 mililitros de PBS, duas vezes, à temperatura ambiente. Deixe 1,5 mililitros de PBS dentro do poço após a última lavagem.Use fórceps e uma cânula para levantar o deslizamento de vidro de cobertura da placa de seis poços e colocá-lo na câmara de gelação. Adicione APS à solução de gelagem e vórtice brevemente. Pipette 200 microliters de solução de gelagem na amostra e fechar cautelosamente a câmara, evitando bolhas de ar dentro do gel.Adicione água à câmara de coloração e incubar a câmara de coloração por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius para polimerizar o gel. Tire a câmara de coloração da incubadora. Para abrir a tampa da câmara de gelação, introduza uma lâmina de barbear entre a tampa e o espaçador e remova a tampa com cautela.Remova os espaçadores com a lâmina de barbear e corte todo o gel extra. Use um pincel para desprender as bordas do gel. Coloque o slide com o gel e cubra o vidro em um prato cheio de PBS.Em seguida, remova o vidro de cobertura separado do gel sacudindo-o suavemente. Coloque o slide abaixo do gel para fixar o gel ao slide. Com o gel no slide, divida o gel em pequenos pedaços usando a lâmina de barbear.Empurre suavemente um pedaço de gel em um poço de uma placa de seis poços com um fundo de vidro e desdobre-o com um pincel. Use o pincel para manter o gel hidratado com uma pequena quantidade de PBS. Usando um microscópio invertido, faça imagens de visão geral com baixa abertura numérica para imagens de pré-expansão.Diluir Proteinase K a quatro unidades por mililitro no tampão de digestão para fazer a solução de digestão. Adicione 500 microliters da solução de digestão a cada poço, e mergulhe o gel dentro da solução. Deixe digerir durante a noite à temperatura ambiente com a tampa fechada para manter as amostras no escuro.Remova a solução de digestão com uma pipeta e descarte-a. Adicione um mililitro de água dupla destilada e incubar o gel imerso por 10 minutos em temperatura ambiente. Retire a água e adicione um mililitro de água fresca e dupla destilada.Continue trocando água a cada 10 minutos até que um platô de expansão seja atingido, fazendo com que o gel fique opticamente claro. Remova a água do gel e inicie imediatamente a microscopia. Usando um microscópio invertido, use um objetivo de ar em baixa ampliação para encontrar células no estado de pré-expansão.Mude para objetivos 40 X e 63 X para uma melhor resolução. Excite-se com o comprimento de onda de interesse e leve a imagem através da câmera. Este protocolo EXM permite a expansão de até quatro vezes.Para determinar o fator de expansão é essencial para as células de imagem antes e depois da expansão. Ancoragem e homogeneização insuficientes podem levar a distorções e rupturas de células. Exemplos representativos de células rompidas são mostrados aqui.Este método pode ser usado para investigar a colocalização de proteínas adaptadora f-actin e actina, como podocina e nefrina. Podocin é retratado em verde, actina em azul, e nefrina em vermelho. Áreas brancas indicam colocalização.A intensidade e abundância do sinal fluorescente são fundamentais para o sucesso exm. A ancoragem eficiente dos corantes fluorescentes via ACX é de fundamental importância para este protocolo. Em nossas mãos o ACX solubilizado é bom por até três a quatro meses.

Research

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Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...